Grazas por visitar Nature.com. A versión do navegador que estás a usar ten soporte CSS limitado. Para obter a mellor experiencia, recomendámosche que utilices un navegador actualizado (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer). Mentres tanto, para garantir a asistencia continua, renderizaremos o sitio sen estilos e JavaScript.
Os termófilos son microorganismos que prosperan a altas temperaturas. O seu estudo pode proporcionar información valiosa sobre como se adapta a vida ás condicións extremas. Non obstante, é difícil conseguir condicións de alta temperatura cos microscopios ópticos convencionais. Propuxéronse varias solucións caseiras baseadas na calefacción eléctrica resistiva local, pero non existe unha solución comercial sinxela. Neste artigo, introducimos o concepto de quecemento con láser a microescala sobre o campo de visión do microscopio para proporcionar altas temperaturas para estudos termófilos mantendo o ambiente do usuario suave. O quecemento a microescala cunha intensidade láser moderada pódese conseguir usando un substrato revestido de nanopartículas de ouro como absorbente de luz biocompatible e eficiente. Discútanse os posibles efectos da convección de fluídos a microescala, a retención celular e o movemento termoforético centrífugo. O método demostrouse en dúas especies: (i) Geobacillus stearothermophilus, unha bacteria termófila activa que se reproduce a uns 65 °C, que observamos xerminar, medrar e nadar baixo quecemento a microescala; (ii) Thiobacillus sp., unha arquea óptimamente hipertermófila. a 80°C. Este traballo abre o camiño para a observación sinxela e segura de microorganismos termófilos utilizando ferramentas de microscopía modernas e accesibles.
Ao longo de miles de millóns de anos, a vida na Terra evolucionou para adaptarse a unha ampla gama de condicións ambientais que ás veces se consideran extremas desde a nosa perspectiva humana. En particular, algúns microorganismos termófilos (bacterias, arqueas, fungos) chamados termófilos prosperan no intervalo de temperaturas de 45 °C a 122 °C1, 2, 3, 4. Os termófilos viven en diversos ecosistemas, como as fontes hidrotermais de augas profundas, as augas termais. ou zonas volcánicas. As súas investigacións xeraron moito interese nas últimas décadas por polo menos dúas razóns. En primeiro lugar, podemos aprender deles, por exemplo, como os termófilos 5, 6, encimas 7, 8 e membranas 9 son estables a temperaturas tan elevadas, ou como os termófilos poden soportar niveis extremos de radiación10. En segundo lugar, son a base de moitas aplicacións biotecnolóxicas importantes1,11,12 como a produción de combustible13,14,15,16, a síntese química (dihidro, alcohois, metano, aminoácidos, etc.)17, a biominería18 e os biocatalizadores termoestables7,11, 13. En particular, a coñecida reacción en cadea da polimerasa (PCR)19 actualmente implica un encima (Taq polimerase) illado da bacteria termófila Thermus aquaticus, un dos primeiros termófilos que se descubriron.
Porén, o estudo dos termófilos non é unha tarefa fácil e non se pode improvisar en ningún laboratorio biolóxico. En particular, os termófilos vivos non se poden observar in vitro con ningún microscopio óptico estándar, mesmo con cámaras de calefacción dispoñibles comercialmente, normalmente clasificadas para temperaturas tan baixas como 40 °C. Desde a década de 1990, só uns poucos grupos de investigación se dedicaron á introdución de sistemas de microscopía de alta temperatura (HTM). En 1994 Glukh et al. A cámara de calefacción/refrixeración foi concibida baseándose no uso dunha célula Peltier que controla a temperatura dos capilares rectangulares pechados para manter a anaerobicidade 20 . O dispositivo pódese quentar ata 100 °C a unha velocidade de 2 °C/s, o que permite aos autores estudar a motilidade da bacteria hipertermófila Thermotoga maritima21. En 1999 Horn et al. Desenvolveuse un dispositivo moi similar, aínda baseado no uso de capilares quentados axeitados para a microscopía comercial para estudar a división/conexión celular. Despois dun longo período de relativa inactividade, a busca de HTM eficaces retomouse en 2012, en particular en relación cunha serie de artigos do grupo Wirth que utilizaban un dispositivo inventado por Horn et al. Hai quince anos, a motilidade dun gran número de arqueas, incluídos os hipertermófilos, foi estudada a temperaturas de ata 100 °C utilizando capilares quentados23,24. Tamén modificaron o microscopio orixinal para conseguir un quecemento máis rápido (varios minutos en lugar de 35 minutos para alcanzar a temperatura establecida) e conseguir un gradiente de temperatura lineal de máis de 2 cm a través do medio. Este dispositivo de conformación do gradiente de temperatura (TGFD) utilizouse para estudar a mobilidade de moitos termófilos dentro dos gradientes de temperatura a distancias bioloxicamente relevantes 24, 25 .
Quentar capilares pechados non é a única forma de observar termófilos vivos. En 2012, Kuwabara et al. Utilizáronse cámaras de Pyrex desbotables e caseiras seladas con adhesivo resistente á calor (Super X2; Cemedine, Xapón). As mostras colocáronse nunha placa de calefacción transparente dispoñible comercialmente (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Xapón) capaz de quentar ata 110 °C, pero non destinada orixinalmente a bioimaxes. Os autores observaron unha división eficiente das bacterias termófilas anaerobias (Thermosipho globiformans, tempo de duplicación de 24 min) a 65 °C. En 2020, Pulshen et al. Demostrouse o quecemento eficiente de pratos metálicos comerciais (AttofluorTM, Thermofisher) utilizando dous elementos de calefacción caseiros: unha tapa e un escenario (configuración inspirada na máquina de PCR). Esta asociación dá lugar a unha temperatura uniforme do líquido e evita a evaporación e a condensación na parte inferior da tapa. O uso dunha junta tórica evita o intercambio de gases co medio ambiente. Este HTM, chamado Sulfoscope, utilizouse para imaxes de Sulfolobus acidocaldarius a 75 °C27.
Unha limitación recoñecida de todos estes sistemas foi a restrición ao uso de obxectivos de aire, sendo calquera inmersión en aceite inadecuada para tan altas temperaturas e para obter imaxes a través de mostras transparentes > 1 mm de espesor. Unha limitación recoñecida de todos estes sistemas foi a restrición ao uso de obxectivos de aire, sendo calquera inmersión en aceite inadecuada para tan altas temperaturas e para obter imaxes a través de mostras transparentes > 1 mm de espesor. Общепризнанным недостатком всех этих систем было ограничение на использование возование возование возоквов ьку любое иммерсионное погружение в масло не подходило для такой высокой температуры и зало подходило для зрачные образцы толщиной > 1 мм. Unha deficiencia recoñecida de todos estes sistemas foi a limitación ao uso de obxectivos de aire, xa que calquera inmersión en aceite non era apta para unha temperatura tan elevada e para a visualización a través de mostras transparentes > 1 mm de espesor.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适吘都不适吘濙适合气物镜，任何油浸都不适吘制是限制使用空气物镜毫米厚的透明样品成像。 Unha limitación recoñecida de todos estes sistemas é a limitación do uso dun espello con aire, xa que calquera inmersión en aceite é inadecuada para obter imaxes de mostras transparentes > 1 mm de espesor a temperaturas tan altas. Ощщепризнанны неостатком вс этих систем является огаченное иъолзоlor ружение в масло непригодно для таких высоких темерат Tes и и в Tesа Tes йensй> 1 пз. Un inconveniente recoñecido de todos estes sistemas é o uso limitado de lentes de aire, calquera inmersión en aceite é inadecuada para temperaturas tan altas e visualización a través de mostras transparentes > 1 mm de espesor.Máis recentemente, esta limitación foi levantada por Charles-Orzag et al. 28, quen desenvolveu un dispositivo que xa non proporciona calor ao redor do sistema de interese, senón dentro do propio cristal de cuberta, cuberto cunha fina capa transparente dunha resistencia feita de ITO (óxido de indio-estaño). A tapa pódese quentar ata 75 °C facendo pasar unha corrente eléctrica a través da capa transparente. Non obstante, o autor tamén debe quentar a lente ata o obxectivo, pero non máis de 65 °C, para non danalo.
Estes traballos demostran que o desenvolvemento dunha microscopía óptica eficiente de alta temperatura non foi amplamente adoptado, moitas veces require equipos caseiros e moitas veces conséguese a costa da resolución espacial, o que supón unha grave desvantaxe dado que os microorganismos termófilos non son máis grandes que uns poucos. micrómetros. O volume de calefacción reducido é a clave para resolver tres problemas inherentes ao HTM: mala resolución espacial, alta inercia térmica cando o sistema se quenta e quecemento prexudicial dos elementos circundantes (aceite de inmersión, lente obxectivo... ou mans do usuario) a temperaturas extremas. ).
Neste artigo, introducimos un HTM para a observación de termófilos que non se basea no quecemento resistivo. Pola contra, conseguimos un quecemento localizado dentro dunha rexión limitada do campo de visión do microscopio mediante a irradiación con láser dun substrato que absorbe a luz. A distribución da temperatura foi visualizada mediante microscopía de fase cuantitativa (QPM). A eficacia deste método está demostrada por Geobacillus stearothermophilus, unha bacteria termófila móbil que se reproduce a uns 65 °C e que ten un curto tempo de duplicación (uns 20 minutos), e Sulfolobus shibatae, un hipertermófilo que crece de forma óptima a 80 °C (archaea). para ilustrar. Observouse a taxa de replicación normal e a natación en función da temperatura. Este láser HTM (LA-HTM) non está limitado polo grosor do cubreobjetos nin pola natureza do obxectivo (inmersión en aire ou aceite). Isto permite utilizar calquera lente de alta resolución do mercado. Tampouco sofre un quentamento lento debido á inercia térmica (consegue un quecemento instantáneo a escala de milisegundos) e só utiliza compoñentes dispoñibles no comercio. As únicas novas preocupacións de seguridade están relacionadas coa presenza de potentes raios láser (normalmente de ata 100 mW) no interior do dispositivo e posiblemente a través dos ollos, que requiren lentes de protección.
O principio de LA-HTM é usar un láser para quentar a mostra localmente dentro do campo de visión do microscopio (Fig. 1a). Para iso, a mostra debe absorber a luz. Para usar unha potencia de láser razoable (menos de 100 mW), non confiamos na absorción de luz polo medio líquido, senón que aumentamos artificialmente a absorción da mostra ao recubrir o substrato con nanopartículas de ouro (Fig. 1c). Quentar nanopartículas de ouro con luz é de fundamental importancia para o campo da plasmónica térmica, con aplicacións esperadas en biomedicina, nanoquímica ou recollida de luz solar29,30,31. Durante os últimos anos, utilizamos este LA-HTM en varios estudos relacionados coas aplicacións do plasma térmico en física, química e bioloxía. A principal dificultade con este método é mostrar o perfil de temperatura final, xa que a temperatura elevada está limitada a unha rexión de microescala dentro da mostra. Demostramos que o mapeo da temperatura pódese conseguir co interferómetro de cizallamento transversal de catro lonxitudes de onda, un método sinxelo, de alta resolución e moi sensible de microscopía de fase cuantitativa baseado no uso de redes de difracción bidimensionais (tamén coñecidas como redes cruzadas). 33,34,35,36. A fiabilidade desta técnica de microscopía térmica, baseada na microscopía de fronte de onda de reixa cruzada (CGM), demostrouse nunha ducia de artigos publicados durante a última década37,38,39,40,41,42,43.
Esquema de instalación de microscopio láser paralelo de calefacción, conformación e temperatura. b Xeometría da mostra que consiste nunha cámara AttofluorTM que contén un cubreobjetos revestido con nanopartículas de ouro. c Observa atentamente a mostra (non a escala). d representa o perfil uniforme do feixe láser e (e) a distribución de temperatura posterior simulada no plano de mostra das nanopartículas de ouro. f é un perfil de raio láser anular axeitado para xerar unha temperatura uniforme como se mostra na simulación da distribución de temperatura resultante mostrada en (g). Barra de escala: 30 µm.
En particular, recentemente conseguimos o quecemento de células de mamíferos con LA-HTM e CGM e rastrexamos as respostas de choque térmico celular no intervalo de 37-42 °C, demostrando a aplicabilidade desta técnica para imaxes de células vivas únicas. Non obstante, a aplicación de LA-HTM ao estudo de microorganismos a altas temperaturas non é inequívoca, xa que require máis precaución en comparación coas células de mamíferos: en primeiro lugar, quentar o fondo do medio en decenas de graos (en lugar de algúns graos) leva a un forte gradiente de temperatura vertical. pode crear convección fluída 44 que, se non está firmemente unida ao substrato, pode provocar movementos indesexables e mestura de bacterias. Esta convección pódese eliminar reducindo o espesor da capa líquida. Para este fin, en todos os experimentos que se presentan a continuación, colocáronse suspensións bacterianas entre dous cubreobjetos de aproximadamente 15 µm de espesor colocados dentro dunha cunca metálica (AttofluorTM, Thermofisher, Fig. 1b,c). En principio, a convección pódese evitar se o espesor do líquido é menor que o tamaño do feixe do láser de calefacción. En segundo lugar, traballar nunha xeometría tan limitada pode sufocar os organismos aeróbicos (ver Fig. S2). Este problema pódese evitar empregando un substrato permeable ao osíxeno (ou calquera outro gas vital), deixando burbullas de aire atrapadas no interior do cubreobjetos ou perforando buratos no cubreobxectos superior (ver Fig. S1) 45 . Neste estudo, escollemos a última solución (Figuras 1b e S1). Finalmente, o quecemento con láser non proporciona unha distribución uniforme da temperatura. Mesmo coa mesma intensidade do feixe láser (Fig. 1d), a distribución da temperatura non é uniforme, senón que se asemella á distribución gaussiana debido á difusión térmica (Fig. 1e). Cando o obxectivo é establecer temperaturas precisas no campo de visión para o estudo dos sistemas biolóxicos, os perfís irregulares non son ideais e tamén poden provocar un movemento termoforético das bacterias se non se adhiren ao substrato (ver Fig. S3, S4)39. Para iso, utilizamos un modulador de luz espacial (SLM) para dar forma ao feixe láser infravermello segundo a forma do anel (Fig. 1f) no plano da mostra para conseguir unha distribución de temperatura perfectamente uniforme dentro dunha área xeométrica determinada, a pesar da difusión térmica (fig. 1d) 39 , 42, 46. Coloque un cubreobjetos superior sobre un prato metálico (figura 1b) para evitar a evaporación do medio e observar polo menos uns días. Debido a que este cubreobjetos superior non está selado, pódese engadir facilmente medio adicional en calquera momento se é necesario.
Para ilustrar o funcionamento do LA-HTM e demostrar a súa aplicabilidade na investigación termófila, estudamos as bacterias aeróbicas Geobacillus stearothermophilus, que teñen unha temperatura óptima de crecemento duns 60-65 °C. A bacteria tamén ten flaxelos e a capacidade de nadar, proporcionando outro indicador da actividade celular normal.
As mostras (Fig. 1b) foron pre-incubadas a 60 ° C durante unha hora e despois colocáronse nun soporte de mostra LA-HTM. Esta preincubación é opcional, pero aínda é útil, por dúas razóns: en primeiro lugar, cando se acende o láser, fai que as células crezan e se dividan inmediatamente (ver película M1 en Materiais suplementarios). Sen preincubación, o crecemento bacteriano adoita atrasar uns 40 minutos cada vez que se quenta unha nova área de visualización na mostra. En segundo lugar, a preincubación de 1 hora promoveu a adhesión das bacterias ao cubreobjetos, evitando que as células saísen do campo de visión debido á termoforese cando se acendeu o láser (ver película M2 en Materiais suplementarios). A termoforese é o movemento de partículas ou moléculas ao longo dun gradiente de temperatura, xeralmente de quente a frío, e as bacterias non son unha excepción43,47. Este efecto indesexable elimínase nunha área determinada mediante o uso de SLM para dar forma ao feixe láser e conseguir unha distribución plana da temperatura.
Sobre a fig. A figura 2 mostra a distribución de temperatura medida por CGM obtida mediante a irradiación dun substrato de vidro revestido de nanopartículas de ouro cun feixe láser anular (Fig. 1f). Observouse unha distribución plana de temperatura en toda a área cuberta polo raio láser. Esta zona estableceuse a 65 °C, a temperatura óptima de crecemento. Fóra desta rexión, a curva de temperatura cae naturalmente a \(1/r\) (onde \(r\) é a coordenada radial).
un Mapa de temperatura de medicións de CGM obtidos mediante o uso dun feixe láser anular para irradiar unha capa de nanopartículas de ouro para obter un perfil de temperatura plano sobre unha área circular. b Isoterma do mapa de temperaturas (a). O contorno do raio láser está representado por un círculo de puntos grises. O experimento repetiuse dúas veces (ver Materiais suplementarios, Figura S4).
A viabilidade das células bacterianas foi monitorizada durante varias horas usando LA-HTM. Sobre a fig. 3 mostra o intervalo de tempo para catro imaxes tomadas dunha película de 3 horas e 20 minutos (Película M3, información complementaria). Observouse que as bacterias proliferaban activamente dentro da área circular definida polo láser onde a temperatura era óptima, aproximándose aos 65 °C. Pola contra, o crecemento celular reduciuse significativamente cando a temperatura caeu por debaixo dos 50 °C durante 10 s.
Imaxes de profundidade óptica de bacterias G. stearothermophilus crecendo despois do quecemento con láser en diferentes momentos, (a) t = 0 min, (b) 1 h 10 min, (c) 2 h 20 min, (d) 3 h 20 min, fóra de 200 Extraído dunha película dun minuto (película M3 proporcionada na Información complementaria) superposta ao mapa de temperaturas correspondente. O láser acende no tempo \(t=0\). Engadíronse isotermas á imaxe de intensidade.
Para cuantificar aínda máis o crecemento celular e a súa dependencia da temperatura, medimos o aumento da biomasa de varias colonias de bacterias inicialmente illadas no campo de visión Movie M3 (Fig. 4). Na figura S6 móstranse as bacterias nais seleccionadas ao comezo da formación de unidades formadoras de mini colonias (mCFU). As medicións de masa seca realizáronse cunha cámara CGM 48 que se utilizou para mapear a distribución da temperatura. A capacidade do CGM para medir o peso seco e a temperatura é a forza do LA-HTM. Como era de esperar, a alta temperatura provocou un crecemento bacteriano máis rápido (Fig. 4a). Como se mostra na gráfica semilogarítmica da figura 4b, o crecemento a todas as temperaturas segue o crecemento exponencial, onde os datos usan a función exponencial \(m={m}_{0}{10}^{t/\tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), onde \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) – tempo de xeración (ou tempo de duplicación), \( g =1/ \tau\) – taxa de crecemento (número de divisións por unidade de tempo). Sobre a fig. A figura 4c mostra a taxa de crecemento e o tempo de xeración respectivos en función da temperatura. Os mCFU de crecemento rápido caracterízanse pola saturación do crecemento despois de dúas horas, un comportamento esperado debido á alta densidade bacteriana (semellante á fase estacionaria nos cultivos líquidos clásicos). A forma xeral \(g\left(T\right)\) (Fig. 4c) corresponde á curva de dúas fases esperada para G. stearothermophilus cunha taxa de crecemento óptima ao redor de 60-65 °C. Relaciona os datos usando un modelo cardinal (Figura S5)49 onde \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °C, que concorda ben con outros valores citados na literatura49. Aínda que os parámetros dependentes da temperatura son reproducibles, a taxa de crecemento máxima de \({G}_{0}\) pode variar dun experimento a outro (ver figuras S7-S9 e película M4). En contraste cos parámetros de axuste de temperatura, que deberían ser universais, a taxa de crecemento máxima depende das propiedades do medio (dispoñibilidade de nutrientes, concentración de osíxeno) dentro da xeometría a microescala observada.
a Crecemento microbiano a varias temperaturas. mCFU: Unidades formadoras de colonias en miniatura. Datos obtidos dun vídeo dunha soa bacteria que crece nun gradiente de temperatura (película M3). b Igual que (a), escala semilogarítmica. c Taxa de crecemento\(\tau\) e tempo de xeración\(g\) calculados a partir da regresión lineal (b). Barras de erro horizontais: intervalo de temperatura sobre o cal os mCFU se expandían ao campo de visión durante o crecemento. Barras de erro verticais: erro estándar de regresión lineal.
Ademais do crecemento normal, algunhas bacterias ás veces flotaban á vista durante o quecemento con láser, que é un comportamento esperado para as bacterias con flaxelos. A película M5 en información adicional mostra tales actividades de natación. Neste experimento, utilizouse a radiación láser uniforme para crear un gradiente de temperatura, como se mostra nas figuras 1d, e e S3. A figura 5 mostra dúas secuencias de imaxes seleccionadas da película M5 que mostran que unha bacteria presenta un movemento direccional mentres que todas as outras permanecen inmóbiles.
Os dous marcos de tempo (a) e (b) mostran a natación de dúas bacterias diferentes marcadas con círculos de puntos. As imaxes foron extraídas da película M5 (proporcionada como material complementario).
No caso de G. stearothermophilus, o movemento activo das bacterias (Fig. 5) comezou uns segundos despois de que se acendese o raio láser. Esta observación fai fincapé na resposta temporal deste microorganismo termófilo ante un aumento da temperatura, como xa observaron Mora et al. 24 . O tema da motilidade bacteriana e mesmo da termotaxe pódese explorar máis a fondo usando LA-HTM.
Non se debe confundir a natación microbiana con outros tipos de movemento físico, a saber (i) o movemento browniano, que parece ser un movemento caótico sen dirección definida, (ii) a convección 50 e a termoforese 43, que consiste nunha deriva regular do movemento ao longo dunha temperatura. gradiente.
G. stearothermophilus é coñecida pola súa capacidade de producir esporas altamente resistentes (formación de esporas) cando se expón a condicións ambientais adversas como defensa. Cando as condicións ambientais se fan de novo favorables, as esporas xerminan, formando células vivas e retomando o crecemento. Aínda que este proceso de esporulación/xerminación é ben coñecido, nunca se observou en tempo real. Usando LA-HTM, informamos aquí da primeira observación de eventos de xerminación en G. stearothermophilus.
Sobre a fig. A figura 6a mostra imaxes de lapso de tempo da profundidade óptica (OT) obtidas mediante un conxunto CGM de 13 esporas. Durante todo o tempo de recollida (15 h 6 min, \(t=0\) - o inicio do quecemento láser), 4 de cada 13 esporas xerminaron, en puntos de tempo sucesivos \(t=2\) h, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' e \(11\) h \(30\)'. Aínda que só se mostra un destes eventos na Figura 6, pódense observar 4 eventos de xerminación na película M6 no material complementario. Curiosamente, a xerminación parece ser aleatoria: non todas as esporas xerminan e non xerminan ao mesmo tempo, a pesar dos mesmos cambios nas condicións ambientais.
a Time-lapse consistente en 8 imaxes OT (inmersión en aceite, 60x, obxectivo 1,25 NA) e (b) evolución da biomasa dos agregados de G. stearothermophilus. c (b) Debuxado nunha escala semilogarítmica para resaltar a linealidade da taxa de crecemento (liña discontinua).
Sobre a fig. 6b,c mostra a biomasa das poboacións celulares no campo de visión en función do tempo durante todo o período de recollida de datos. A rápida desintegración da masa seca observada en \(t=5\)h na fig. 6b, c, debido á saída dalgunhas celas do campo de visión. A taxa de crecemento destes catro eventos é \(0,77\pm 0,1\) h-1. Este valor é superior á taxa de crecemento asociada á Figura 3. 3 e 4, onde as células crecen normalmente. A razón do aumento da taxa de crecemento de G. stearothermophilus a partir de esporas non está clara, pero estas medicións destacan o interese de LA-HTM e traballan a nivel de célula única (ou a nivel de mCFU único) para aprender máis sobre a dinámica da vida celular. .
Para demostrar aínda máis a versatilidade de LA-HTM e o seu rendemento a altas temperaturas, examinamos o crecemento de Sulfolobus shibatae, unha arquea acidófila hipertermófila cunha temperatura óptima de crecemento de 80 °C51. En comparación con G. stearothermophilus, estas arqueas tamén teñen unha morfoloxía moi diferente, semellando esferas de 1 micra (cocos) en lugar de bastoncillos alongados (bacilos).
A figura 7a consiste en imaxes de profundidade óptica secuenciais de mCFU de S. shibatae obtidas mediante CGM (ver a longametraxe M7 en Materiais suplementarios). Este mCFU crece a uns 73 °C, por debaixo da temperatura óptima de 80 °C, pero dentro do intervalo de temperatura para o crecemento activo. Observamos múltiples eventos de fisión que fixeron que os mCFU parezan microuvas de arqueas despois dunhas horas. A partir destas imaxes OT, a biomasa de mCFU foi medida ao longo do tempo e presentouse na figura 7b. Curiosamente, os mCFU de S. shibatae mostraron un crecemento lineal en lugar do crecemento exponencial observado cos mCFU de G. stearothermophilus. Hai unha longa discusión 52 sobre a natureza das taxas de crecemento celular: mentres algúns estudos informan de taxas de crecemento de microbios que son proporcionais ao seu tamaño (crecemento exponencial), outros mostran unha taxa constante (crecemento lineal ou bilineal). Tal e como explican Tzur et al.53, distinguir entre crecemento exponencial e (bi)lineal require unha precisión de <6% nas medicións de biomasa, que está fóra do alcance da maioría das técnicas QPM, incluso implicando interferometría. Tal e como explican Tzur et al.53, distinguir entre crecemento exponencial e (bi)lineal require unha precisión de <6% nas medicións de biomasa, que está fóra do alcance da maioría das técnicas QPM, incluso implicando interferometría. Как объяснили Цур и др.53, различение экспоненциального и (би)линейного роста трезличение экспоненциального и (би)линейного роста третен 6% х биомассы, что недостижимо для большинства методов QPM, даже с использованием интерием интерфери. Tal e como explican Zur et al.53, distinguir entre crecemento exponencial e (bi)lineal require unha precisión <6% nas medicións de biomasa, o que é inalcanzable para a maioría dos métodos QPM, mesmo usando interferometría.Segundo explican Zur et al. 53, distinguir entre crecemento exponencial e (bi)lineal require menos do 6% de precisión nas medicións de biomasa, que é inalcanzable para a maioría dos métodos QPM, mesmo cando se usa interferometría. CGM consegue esta precisión cunha precisión sub-pg nas medicións de biomasa36,48.
a Time-lapse consistente en 6 imaxes OT (inmersión en aceite, 60x, obxectivo NA 1.25) e (b) evolución da biomasa micro-CFU medida con CGM. Vexa a película M7 para obter máis información.
O crecemento perfectamente lineal de S. shibatae foi inesperado e aínda non se informou. Non obstante, espérase un crecemento exponencial, polo menos porque co paso do tempo, deben producirse múltiples divisións de 2, 4, 8, 16... células. A hipótese de que o crecemento lineal podería deberse á inhibición celular debido ao empaquetamento celular denso, do mesmo xeito que o crecemento celular se ralentiza e finalmente chega a un estado latente cando a densidade celular é demasiado alta.
Concluímos comentando á súa vez os seguintes cinco puntos de interese: redución do volume de quentamento, redución da inercia térmica, interese polas nanopartículas de ouro, interese pola microscopia de fase cuantitativa e un posible intervalo de temperatura no que se pode utilizar LA-HTM.
En comparación co quecemento resistivo, o quecemento láser usado para o desenvolvemento de HTM ofrece varias vantaxes, que ilustramos neste estudo. En particular, en medios líquidos no campo de visión do microscopio, o volume de quecemento mantense nuns poucos (10 μm) 3 volumes. Deste xeito, só os microbios observados están activos, mentres que outras bacterias están latentes e poden usarse para estudar máis a mostra; non é necesario cambiar a mostra cada vez que hai que comprobar unha nova temperatura. Ademais, o quecemento a microescala permite o exame directo dunha gran variedade de temperaturas: a figura 4c obtívose a partir dunha película de 3 horas (Película M3), que normalmente require a preparación e o exame de varias mostras, unha para cada unha das mostras obxecto de estudo. y é a temperatura que representa o número de días no experimento. Ao reducir o volume quentado tamén se mantén todos os compoñentes ópticos circundantes do microscopio, especialmente a lente obxectivo, a temperatura ambiente, o que foi un problema importante ao que se enfrontou a comunidade ata agora. LA-HTM pódese usar con calquera lente, incluídas as de inmersión en aceite, e permanecerá a temperatura ambiente mesmo con temperaturas extremas no campo de visión. A principal limitación do método de quecemento con láser que informamos neste estudo é que as células que non se adhiren nin flotan poden estar lonxe do campo de visión e difíciles de estudar. Unha solución alternativa podería ser usar lentes de baixo aumento para conseguir un aumento de temperatura maior que supere algúns centos de micras. Esta precaución vai acompañada dunha diminución da resolución espacial, pero se o obxectivo é estudar o movemento dos microorganismos non é necesaria unha alta resolución espacial.
A escala de tempo para quentar (e arrefriar) o sistema \({{{{{\rm{\tau }}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) depende do seu tamaño, segundo a lei \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), onde \ (L\ ) é o tamaño característico da fonte de calor (o diámetro do feixe láser no noso estudo é \(L\ uns 100\) μm), \(D\) é a difusividade térmica do ambiente (media no noso estudo). caso, vidro e auga Velocidade de difusión\(D\ aproximadamente 2\{10}^{-7}\) m2/s Polo tanto, neste estudo, respostas de tempo da orde de 50 ms, é dicir, case instantáneas). Este establecemento instantáneo do aumento da temperatura non só acurta a duración do experimento, senón que tamén permite un tempo preciso \(t=0\) para calquera estudo dinámico dos efectos da temperatura.
O noso método proposto é aplicable a calquera substrato que absorba a luz (por exemplo, mostras comerciais con revestimento de ITO). Non obstante, as nanopartículas de ouro son capaces de proporcionar unha alta absorción no infravermello e unha baixa absorción no rango visible, as últimas características das cales son de interese para unha observación óptica eficaz no rango visible, especialmente cando se usa fluorescencia. Ademais, o ouro é biocompatible, químicamente inerte, a densidade óptica pódese axustar de 530 nm ao infravermello próximo e a preparación da mostra é sinxela e económica29.
A microscopía de fronte de onda de reixa transversal (CGM) permite non só o mapeo da temperatura a microescala, senón tamén o seguimento da biomasa, polo que é especialmente útil (se non é necesario) en combinación con LA-HTM. Durante a última década desenvolvéronse outras técnicas de microscopía de temperatura, especialmente no campo da bioimaxe, e a maioría delas requiren o uso de sondas fluorescentes sensibles á temperatura54,55. Non obstante, estes métodos foron criticados e algúns informes mediron cambios de temperatura pouco realistas dentro das células, posiblemente debido ao feito de que a fluorescencia depende de moitos factores distintos da temperatura. Ademais, a maioría das sondas fluorescentes son inestables a altas temperaturas. Polo tanto, QPM e en particular CGM representan unha técnica de microscopía de temperatura ideal para estudar a vida a altas temperaturas usando microscopía óptica.
Os estudos de S. shibatae, que viven de forma óptima a 80 °C, mostran que o LA-HTM pódese aplicar para estudar hipertermófilos, non só termófilos simples. En principio, non hai límite para o intervalo de temperaturas que se pode alcanzar usando LA-HTM, e mesmo se poden alcanzar temperaturas superiores a 100 °C a presión atmosférica sen ferver, como demostra o noso grupo de 38 en aplicacións de química hidrotermal a temperatura atmosférica. presión A. Úsase un láser para quentar as nanopartículas de ouro 40 do mesmo xeito. Así, LA-HTM ten o potencial de ser usado para observar hipertermófilos sen precedentes con microscopía óptica estándar de alta resolución en condicións estándar (é dicir, baixo estrés ambiental).
Todos os experimentos realizáronse utilizando un microscopio caseiro, incluíndo iluminación Köhler (con LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), soporte para mostras con movemento manual xy, obxectivos (Olympus, 60x, 0,7 NA, aire, LUCPlanFLN60X ou 60x, 1,25 NA, aceite). , UPLFLN60XOI), cámara CGM (reixa cruzada QLSI, paso de 39 µm, 0,87 mm do sensor da cámara Andor Zyla) para proporcionar imaxes de intensidade e fronte de onda, e cámara sCMOS (ORCA Flash 4.0 V3, modo de 16 bits, de Hamamatsu) para gravar datos mostrados na Figura 5 (natación bacteriana). O divisor de feixe dicroico é un bordo BrightLine de 749 nm (Semrock, FF749-SDi01). O filtro da parte frontal da cámara é un filtro de paso curto 694 (FF02-694/SP-25, Semrock). Láser de zafiro de titanio (Láser Verdi G10, 532 nm, 10 W, cavidade láser de tsunami bombeada, Spectra-Physics na figura 2-5, substituído ademais por láser Millenia, Spectraphysics 10 W, cavidade láser Mira bombeada, Coherent, para a figura 2). -5). 6 e 7) están configurados para a lonxitude de onda \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm, que corresponde ao espectro de resonancia plasmónica das nanopartículas de ouro. Moduladores de luz espaciais (1920 × 1152 píxeles) foron adquiridos de Meadowlark Optics.
A microscopía de fronte de onda de reixa cruzada (CGM) é unha técnica de microscopía óptica baseada na combinación dunha reixa de difracción bidimensional (tamén coñecida como reixa cruzada) a unha distancia dun milímetro do sensor dunha cámara convencional. O exemplo máis común de CGM que usamos neste estudo chámase interferómetro de desprazamento transversal de catro lonxitudes de onda (QLSI), onde a reixa cruzada consiste nun patrón de taboleiro de dados intensidade/fase introducido e patentado por Primot et al. en 200034. As liñas de reixa verticais e horizontais crean sombras en forma de reixa no sensor, cuxa distorsión pode ser procesada numericamente en tempo real para obter a distorsión da fronte de onda óptica (ou o perfil de fase equivalente) da luz incidente. Cando se usa nun microscopio, unha cámara CGM pode mostrar a diferenza do camiño óptico dun obxecto coa imaxe, tamén coñecida como profundidade óptica (OT), cunha sensibilidade da orde dos nanómetros36. En calquera medición de CGM, para eliminar calquera defecto nos compoñentes ópticos ou feixes, débese tomar unha imaxe OT de referencia primaria e restar das imaxes posteriores.
A microscopia de temperatura realizouse mediante unha cámara CGM como se describe na referencia. 32. En resumo, quentar un líquido cambia o seu índice de refracción, creando un efecto de lente térmica que distorsiona o feixe incidente. Esta distorsión da fronte de onda é medida polo CGM e procesada mediante un algoritmo de deconvolución para obter unha distribución tridimensional da temperatura no medio líquido. Se as nanopartículas de ouro se distribúen uniformemente por toda a mostra, o mapeo da temperatura pódese facer en áreas libres de bacterias para producir mellores imaxes, que é o que facemos ás veces. A imaxe CGM de referencia adquiriuse sen quentarse (co láser apagado) e posteriormente capturouse no mesmo lugar da imaxe co láser acendido.
A medición da masa seca conséguese usando a mesma cámara CGM utilizada para a imaxe da temperatura. As imaxes de referencia do CGM obtivéronse movendo rapidamente a mostra en x e y durante a exposición como un medio para promediar calquera falta de homoxeneidade no TO debido á presenza de bacterias. A partir de imaxes OT de bacterias, a súa biomasa obtívose mediante un conxunto de imaxes sobre áreas seleccionadas mediante o algoritmo de segmentación caseira de Matlab (ver subsección "Código numérico"), seguindo o procedemento descrito na ref. 48. En resumo, usamos a relación \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), onde \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) é a imaxe de profundidade óptica, \(m\) é o peso seco e \({{{{{\rm{\alpha }}}}}}\) é unha constante. Escollemos \({{{{\rm{\alpha})))))=0,18\) µm3/pg, que é unha constante típica das células vivas.
Colocouse un cubreobjetos de 25 mm de diámetro e 150 µm de espesor revestido con nanopartículas de ouro nunha cámara AttofluorTM (Thermofisher) coas nanopartículas de ouro cara arriba. Geobacillus stearothermophilus foi precultivo durante a noite en medio LB (200 rpm, 60 ° C) antes de cada día de experimentos. Colocouse unha gota de 5 µl dunha suspensión de G. stearothermophilus cunha densidade óptica (DO) de 0,3 a 0,5 sobre un cubreobjetos con nanopartículas de ouro. Despois, un cubreobjetos redondo de 18 mm de diámetro cun buraco de 5 mm de diámetro no centro deixouse caer sobre a gota e aplicáronse repetidamente 5 μl de suspensión bacteriana coa mesma densidade óptica no centro do buraco. Os pozos sobre cubreobjetos preparáronse segundo o procedemento descrito na ref. 45 (consulte Información complementaria para obter máis información). A continuación, engade 1 ml de medio LB ao cubreobjetos para evitar que a capa líquida se seque. O último cubreobjetos colócase sobre a tapa pechada da cámara Attofluor™ para evitar a evaporación do medio durante a incubación. Para os experimentos de xerminación, utilizamos esporas que, despois dos experimentos convencionais, ás veces cubrían o cubreobjetos superior. Utilizouse un método similar para obter Sulfolobus shibatae. Realizáronse tres días (200 rpm, 75 °C) de cultivo preliminar de Thiobacillus serrata en medio 182 (DSMZ).
Preparáronse mostras de nanopartículas de ouro mediante litografía de copolímeros de bloques micelares. Este proceso descríbese en detalle no cap. 60. Brevemente, sintetizáronse micelas que encapsulaban ións de ouro mesturando o copolímero con HAuCl4 en tolueno. Os cubreobjetos limpos foron mergullados na solución e tratados con irradiación UV en presenza dun axente reductor para obter sementes de ouro. Finalmente, cultivouse sementes de ouro poñendo en contacto un cubreobjetos cunha solución acuosa de KAuCl4 e etanolamina durante 16 minutos, o que deu lugar a unha disposición case periódica e moi uniforme de nanopartículas de ouro non esféricas no infravermello próximo.
Para converter os interferogramas en imaxes OT, usamos un algoritmo caseiro, como se detalla na ligazón. 33 e está dispoñible como paquete Matlab no seguinte repositorio público: https://github.com/baffou/CGMprocess. O paquete pode calcular imaxes de intensidade e OT baseándose en interferogramas gravados (incluíndo imaxes de referencia) e distancias da matriz de cámaras.
Para calcular o patrón de fase aplicado ao SLM para obter un determinado perfil de temperatura, utilizamos un algoritmo caseiro desenvolvido previamente39,42 que está dispoñible no seguinte repositorio público: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. A entrada é o campo de temperatura desexado, que se pode configurar dixitalmente ou mediante unha imaxe bmp monocromática.
Para segmentar as células e medir o seu peso seco, utilizamos o noso algoritmo Matlab publicado no seguinte repositorio público: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. En cada imaxe, o usuario debe facer clic na bacteria ou mCFU de interese, axustar a sensibilidade da variña e confirmar a selección.
Para obter máis información sobre o deseño do estudo, consulte o resumo do informe de investigación da natureza vinculado a este artigo.
Os datos que apoian os resultados deste estudo están dispoñibles dos respectivos autores previa solicitude razoable.
O código fonte utilizado neste estudo detállase na sección Métodos, e as versións de depuración pódense descargar de https://github.com/baffou/ nos seguintes repositorios: SLM_temperatureShaping, CGMprocess e CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Perspectiva dos termófilos e as súas aplicacións de amplo espectro. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Perspectiva dos termófilos e as súas aplicacións de amplo espectro.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. e Sharma, AK Visión xeral dos termófilos e a súa ampla aplicación. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. e Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. e Sharma AK Un profundo coñecemento dos termófilos e unha ampla gama de aplicacións.3 Biotecnoloxía 6, 81 (2016).
Hora de publicación: 26-09-2022