A enfermidade de Alzheimer (EA) carece de biomarcadores proteicos que reflictan a súa múltiple fisiopatoloxía subxacente, o que dificulta o progreso do diagnóstico e tratamento. Aquí, usamos proteómica completa para identificar biomarcadores de líquido cefalorraquídeo (LCR) que representan unha ampla gama de fisiopatoloxía da EA. A espectrometría de masas múltiplex identificou aproximadamente 3.500 e aproximadamente 12.000 proteínas no LCR da EA e no cerebro, respectivamente. A análise da rede do proteoma cerebral resolveu 44 módulos de biodiversidade, 15 dos cales se solapaban co proteoma do líquido cefalorraquídeo. Os marcadores DA LCR nestes módulos superpostos están dobrados en cinco grupos de proteínas, que representan diferentes procesos fisiopatolóxicos. As sinapses e os metabolitos do cerebro da DA diminúen, pero o LCR aumenta, mentres que a mielinización rica en glial e os grupos inmunes no cerebro e no LCR aumentan. A consistencia e a especificidade da enfermidade dos cambios do panel confirmáronse en máis de 500 mostras adicionais de LCR. Estes grupos tamén identificaron subgrupos biolóxicos na EA asintomática. En xeral, estes resultados son un paso prometedor cara a ferramentas de biomarcadores baseadas na web para aplicacións clínicas na EA.
A enfermidade de Alzheimer (EA) é a causa máis común de demencia neurodexenerativa en todo o mundo e caracterízase por unha ampla gama de disfuncións do sistema biolóxico, incluíndo a transmisión sináptica, a inmunidade mediada pola glial e o metabolismo mitocondrial (1-3). Non obstante, os seus biomarcadores de proteínas establecidos aínda se centran na detección da proteína amiloide e tau e, polo tanto, non poden reflectir esta fisiopatoloxía diversa. Estes biomarcadores de proteínas "núcleos" que se miden de forma máis fiable no líquido cefalorraquídeo (LCR) inclúen (i) o péptido beta amiloide 1-42 (Aβ1-42), que reflicte a formación de placas amiloides corticais; (ii) tau total, un sinal de dexeneración do axón; (iii) fosfo-tau (p-tau), un representante da hiperfosforilación patolóxica de tau (4-7). Aínda que estes biomarcadores de líquido cefalorraquídeo facilitaron moito a nosa detección de enfermidades da proteína DA "marcadas" (4-7), só representan unha pequena parte da complexa bioloxía detrás da enfermidade.
A falta de diversidade fisiopatolóxica dos biomarcadores da EA levou a moitos desafíos, incluíndo (i) a incapacidade para identificar e cuantificar a heteroxeneidade biolóxica dos pacientes con EA, (ii) a medición insuficiente da gravidade e progresión da enfermidade, especialmente na fase preclínica, e (ii) iii) o desenvolvemento de fármacos terapéuticos que non lograron resolver completamente todos os aspectos do deterioro neurolóxico. A nosa dependencia da patoloxía histórica para describir a EA de enfermidades relacionadas só agrava estes problemas. Cada vez son máis as evidencias que mostran que a maioría das persoas maiores con demencia teñen máis dunha característica patolóxica do deterioro cognitivo (8). Ata o 90% ou máis dos individuos con patoloxía da EA tamén teñen enfermidades vasculares, inclusións de TDP-43 ou outras enfermidades dexenerativas (9). Estas altas proporcións de solapamento patolóxico interromperon o noso marco diagnóstico actual para a demencia, e é necesaria unha definición fisiopatolóxica máis completa da enfermidade.
En vista da necesidade urxente dunha variedade de biomarcadores DA, o campo está adoptando cada vez máis o método "ómico" baseado no sistema global para descubrir biomarcadores. A Alianza Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD foi lanzada en 2014 e está á vangarda do programa. Este esforzo multidisciplinar dos Institutos Nacionais de Saúde, a academia e a industria ten como obxectivo utilizar estratexias baseadas no sistema para definir mellor a fisiopatoloxía da EA e desenvolver estratexias de análise e tratamento de diagnóstico da biodiversidade (10). Como parte deste proxecto, a proteómica en rede converteuse nunha ferramenta prometedora para o avance de biomarcadores baseados en sistemas na EA. Este enfoque imparcial orientado a datos organiza conxuntos complexos de datos de proteómica en grupos ou "módulos" de proteínas coexpresadas que están asociadas con tipos celulares específicos, orgánulos e funcións biolóxicas (11-13). Realizáronse case 12 estudos de proteómica de redes ricas en información sobre o cerebro de AD (13-23). En xeral, estas análises indican que o proteoma da rede cerebral de AD mantén unha organización modular moi conservada en cohortes independentes e varias rexións corticais. Ademais, algúns destes módulos mostran cambios reproducibles na abundancia relacionada coa EA en conxuntos de datos, o que reflicte a fisiopatoloxía de múltiples enfermidades. En conxunto, estes achados demostran un punto de ancoraxe prometedor para o descubrimento do proteoma da rede cerebral como un biomarcador baseado no sistema na EA.
Para transformar o proteoma da rede cerebral de AD en biomarcadores clínicamente útiles baseados en sistemas, combinamos a rede derivada do cerebro coa análise proteómica de AD CSF. Este enfoque integrado levou á identificación de cinco conxuntos prometedores de biomarcadores de LCR que están asociados a unha ampla gama de fisiopatoloxía baseada no cerebro, incluíndo sinapses, vasos sanguíneos, mielinización, inflamación e disfunción das vías metabólicas. Validamos con éxito estes paneis de biomarcadores mediante múltiples análises de replicación, incluíndo máis de 500 mostras de LCR de varias enfermidades neurodexenerativas. Estas análises de validación inclúen examinar obxectivos grupais no LCR de pacientes con DA asintomática (AsymAD) ou mostrar evidencias de acumulación anormal de amiloide nun ambiente cognitivo normal. Estas análises destacan a heteroxeneidade biolóxica significativa na poboación de AsymAD e identifican marcadores de panel que poden ser capaces de subtipo individuos nas fases máis temperás da enfermidade. En xeral, estes resultados representan un paso clave no desenvolvemento de ferramentas de biomarcadores de proteínas baseadas en múltiples sistemas que poden resolver con éxito moitos dos desafíos clínicos aos que se enfronta a EA.
O obxectivo principal deste estudo é identificar novos biomarcadores do líquido cefalorraquídeo que reflictan diversas fisiopatoloxías baseadas no cerebro que conducen á EA. A figura S1 resume a nosa metodoloxía de investigación, que inclúe (i) unha análise exhaustiva impulsada polos achados preliminares de AD LCR e do proteoma do cerebro en rede para identificar múltiples biomarcadores da enfermidade do LCR relacionados co cerebro, e (ii) a replicación posterior. cohortes fluídas. A investigación orientada ao descubrimento comezou coa análise da expresión diferencial do LCR en 20 individuos cognitivamente normais e 20 pacientes con AD no Centro de Investigación da Enfermidade de Alzheimer de Emory Goizueta (ADRC). O diagnóstico de DA defínese como un deterioro cognitivo significativo en presenza de Aβ1-42 baixo e niveis elevados de tau total e p-tau no líquido cefalorraquídeo [Mean Montreal Cognitive Assessment (MoCA), 13,8 ± 7,0] [ELISA (ELISA). )]] (Táboa S1A). O control (MoCA medio, 26,7 ± 2,2) tiña niveis normais de biomarcadores de LCR.
O LCR humano caracterízase por un rango dinámico de abundancia de proteínas, no que a albúmina e outras proteínas extremadamente abundantes poden impedir a detección de proteínas de interese (24). Para aumentar a profundidade do descubrimento de proteínas, eliminamos as primeiras 14 proteínas moi abundantes de cada mostra de LCR antes da análise por espectrometría de masas (MS) (24). Un total de 39.805 péptidos foron identificados pola MS, que foron mapeados con 3691 proteomas en 40 mostras. A cuantificación das proteínas realízase mediante o etiquetado de múltiples etiquetas de masa en tándem (TMT) (18, 25). Para resolver os datos que faltan, incluímos só aquelas proteínas que foron cuantificadas en polo menos o 50% das mostras na análise posterior, cuantificando así finalmente 2875 proteomas. Debido á diferenza significativa nos niveis de abundancia total de proteínas, unha mostra de control considerouse estatísticamente un valor atípico (13) e non se incluíu na análise posterior. Os valores de abundancia das 39 mostras restantes axustáronse segundo a idade, o sexo e a covarianza do lote (13-15, 17, 18, 20, 26).
Usando a análise estatística da proba t para avaliar a expresión diferencial no conxunto de datos de regresión, esta análise identificou proteínas cuxos niveis de abundancia cambiaron significativamente (P <0,05) entre os casos control e AD (táboa S2A). Como se mostra na Figura 1A, a abundancia dun total de 225 proteínas en AD reduciuse significativamente e a abundancia de 303 proteínas aumentou significativamente. Estas proteínas expresadas de forma diferencial inclúen varios marcadores de AD de líquido cefalorraquídeo identificados previamente, como a proteína tau asociada a microtúbulos (MAPT; P = 3,52 × 10−8), neurofilamento (NEFL; P = 6,56 × 10−3), proteína relacionada co crecemento 43 (GAP43; P = 1,46 × 10−5), Fatty Acid Binding Protein 3 (FABP3; P = 2,00 × 10−5), Quitinase 3 like 1 (CHI3L1; P = 4,44 × 10−6), Granulina Neural (NRGN; P = 3,43 × 10−4) e factor de crecemento nervioso VGF (VGF; P = 4,83 × 10−3) (4-6). Non obstante, tamén identificamos outros obxectivos moi importantes, como o inhibidor da disociación do PIB 1 (GDI1; P = 1,54 × 10-10) e a unión de calcio modular relacionada con SPARC 1 (SMOC1; P = 6,93 × 10-9). A análise de Ontoloxía xenética (GO) de 225 proteínas significativamente reducidas revelou conexións estreitas con procesos de fluídos corporais como o metabolismo de esteroides, a coagulación do sangue e a actividade hormonal (Figura 1B e Táboa S2B). Pola contra, o aumento significativo da proteína de 303 está intimamente relacionado coa estrutura celular e o metabolismo enerxético.
(A) O gráfico do volcán mostra o cambio de dobra logarítmico 2 (eixe x) en relación co valor P estatístico -log10 (eixe y) obtido pola proba t, que se usa para detectar a expresión diferencial entre o control (CT) e Casos de AD do proteoma LCR De todas as proteínas. As proteínas con niveis significativamente reducidos (P <0,05) na EA móstranse en azul, mentres que as proteínas con niveis significativamente aumentados de enfermidade móstranse en vermello. A proteína seleccionada está marcada. (B) Os termos GO principais relacionados coa proteína redúcense significativamente (azul) e aumentan (vermello) en AD. Mostra os tres termos GO coas puntuacións z máis altas nos campos dos procesos biolóxicos, funcións moleculares e compoñentes celulares. (C) MS mediu o nivel de MAPT na mostra de LCR (esquerda) e a súa correlación co nivel de ELISA tau da mostra (dereita). Móstrase o coeficiente de correlación de Pearson co valor P relevante. Debido á falta de datos ELISA para un caso de EA, estas cifras inclúen valores para 38 dos 39 casos analizados. (D) Análise de cluster supervisada (P <0,0001, Benjamini-Hochberg (BH) axustado P <0,01) no control e AD CSF atopou mostras usando as 65 proteínas máis significativamente modificadas no conxunto de datos. Normalizar, normalizar.
O nivel proteómico de MAPT está intimamente relacionado co nivel de ELISA tau medido de forma independente (r = 0,78, P = 7,8 × 10-9; Figura 1C), apoiando a validez da nosa medida de MS. Despois da dixestión de tripsina a nivel de proteína precursora de amiloide (APP), os péptidos específicos da isoforma asignados ao extremo C-terminal de Aβ1-40 e Aβ1-42 non se poden ionizar de forma eficiente (27, 28). Polo tanto, os péptidos APP que identificamos non teñen nada que ver cos niveis de ELISA Aβ1-42. Para avaliar a expresión diferencial de cada caso, utilizamos proteínas expresadas de forma diferencial con P <0,0001 [taxa de descubrimento falso (FDR) corrixida P <0,01] para realizar unha análise de cluster supervisada das mostras (táboa S2A). Como se mostra na Figura 1D, estas 65 proteínas altamente significativas poden agrupar correctamente mostras segundo o estado da enfermidade, agás un caso de AD con características de control. Destas 65 proteínas, 63 aumentaron en AD, mentres que só dúas (CD74 e ISLR) diminuíron. En total, estas análises de líquido cefalorraquídeo identificaron centos de proteínas na EA que poden servir como biomarcadores da enfermidade.
Despois realizamos unha análise de rede independente do proteoma cerebral da AD. A cohorte cerebral deste descubrimento incluíu o córtex prefrontal dorsolateral (DLPFC) dos casos control (n = 10), enfermidade de Parkinson (PD; n = 10), AD/PD mixto (n = 10) e AD (n = 10). ) Mostra. Emery Goizueta ADRC. Os datos demográficos destes 40 casos foron descritos previamente (25) e resúmense na táboa S1B. Usamos TMT-MS para analizar estes 40 tecidos cerebrais e a cohorte de replicación de 27 casos. En total, estes dous conxuntos de datos cerebrais produciron 227.121 péptidos únicos, que se asignaron a 12.943 proteomas (25). Só aquelas proteínas que foron cuantificadas en polo menos o 50% dos casos foron incluídas en investigacións posteriores. O conxunto de datos do descubrimento final contén 8817 proteínas cuantificadas. Axuste os niveis de abundancia de proteínas en función da idade, o sexo e o intervalo post mortem (PMI). A análise de expresión diferencial do conxunto de datos despois da regresión mostrou que os niveis de proteína > 2000 cambiaron significativamente [P <0,05, análise da varianza (ANOVA)] en dúas ou máis cohortes de enfermidades. Despois, realizamos unha análise de clúster supervisada baseada nas proteínas expresadas de forma diferencial e P <0,0001 nas comparacións AD/control e/ou AD/PD (Figura S2, A e B, Táboa S2C). Estas 165 proteínas altamente alteradas representan con claridade casos con patoloxía da EA a partir das mostras de control e de PD, confirmando os fortes cambios específicos da EA en todo o proteoma.
Despois utilizamos un algoritmo chamado Análise de rede de coexpresión xenética ponderada (WGCNA) para realizar análises de rede sobre o proteoma cerebral descuberto, que organiza o conxunto de datos en módulos de proteínas con patróns de expresión similares (11-13). A análise identificou 44 módulos (M) de proteínas coexpresadas, ordenadas e numeradas desde as máis grandes (M1, n = 1821 proteínas) ata as máis pequenas (M44, n = 34 proteínas) (Figura 2A e Táboa S2D). Como se mencionou anteriormente (13) Calcula o perfil de expresión representativo ou a proteína característica de cada módulo, e correlacionao co estado da enfermidade e a patoloxía da EA, é dicir, establece a alianza do Rexistro de Enfermidade de Alzheimer (CERAD) e a puntuación de Braak (Figura 2B). En xeral, 17 módulos estaban significativamente relacionados coa neuropatoloxía da EA (P <0,05). Moitos destes módulos relacionados coa enfermidade tamén son ricos en marcadores específicos de tipo celular (Figura 2B). Como se mencionou anteriormente (13), o enriquecemento do tipo celular determínase analizando a superposición de módulos e a lista de referencia de xenes específicos do tipo celular. Estes xenes derivan de datos publicados en neuronas illadas de rato, células endoteliais e gliais. Experimento de secuenciación de ARN (ARN-seq) (29).
(A) Descubra o WGCNA do proteoma cerebral. (B) Análise de correlación media bipeso (BiCor) da proteína de sinatura modular (o primeiro compoñente principal da expresión da proteína modular) con características neuropatolóxicas de AD (arriba), incluíndo puntuacións CERAD (placa Aβ) e Braak (enredos tau). As intensidades das correlacións positivas (vermello) e negativas (azul) móstranse mediante un mapa térmico de dúas cores, e os asteriscos indican significación estatística (P <0,05). Use Hypergeometric Fisher's Exact Test (FET) (abaixo) para avaliar a asociación de tipo celular de cada módulo de proteína. A intensidade do sombreado vermello indica o grao de enriquecemento do tipo celular e o asterisco indica a significación estatística (P <0,05). Use o método BH para corrixir o valor P derivado do FET. (C) Análise GO de proteínas modulares. Os procesos biolóxicos máis estreitamente relacionados móstranse para cada módulo ou grupo de módulos relacionados. oligo, oligodendrocito.
Un conxunto de cinco módulos ricos en astrocitos e microglia moi relacionados (M30, M29, M18, M24 e M5) mostraron unha forte correlación positiva coa neuropatoloxía da EA (Figura 2B). A análise ontolóxica vincula estes módulos gliais co crecemento celular, a proliferación e a inmunidade (figura 2C e táboa S2E). Dous módulos gliais adicionais, M8 e M22, tamén están fortemente regulados na enfermidade. M8 está moi relacionado coa vía do receptor Toll-like, unha fervenza de sinalización que xoga un papel fundamental na resposta inmune innata (30). Ao mesmo tempo, M22 está intimamente relacionado coa modificación postraducional. M2, que é rico en oligodendrocitos, mostra unha forte correlación positiva coa patoloxía da DA e unha conexión ontolóxica coa síntese de nucleósidos e a replicación do ADN, o que indica unha maior proliferación celular nas enfermidades. En xeral, estes achados apoian a elevación de módulos gliais que observamos anteriormente no proteoma da rede AD (13, 17). Actualmente atópase que moitos módulos gliais relacionados coa EA na rede mostran niveis de expresión máis baixos en casos de control e PD, destacando a súa especificidade de enfermidade que está elevada na EA (Figura S2C).
Só catro módulos do noso proteoma de rede (M1, M3, M10 e M32) están fortemente correlacionados negativamente coa patoloxía da EA (P <0,05) (Figura 2, B e C). Tanto M1 como M3 son ricos en marcadores neuronais. M1 está moi relacionado cos sinais sinápticos, mentres que M3 está moi relacionado coa función mitocondrial. Non hai evidencia de enriquecemento de tipo celular para M10 e M32. M32 reflicte a conexión entre M3 e o metabolismo celular, mentres que M10 está moi relacionada co crecemento celular e a función dos microtúbulos. En comparación coa DA, os catro módulos increméntanse no control e na PD, o que lles dá cambios específicos da enfermidade (Figura S2C). En xeral, estes resultados apoian a diminución da abundancia de módulos ricos en neuronas que observamos anteriormente en AD (13, 17). En resumo, a análise da rede do proteoma cerebral que descubrimos produciu módulos alterados específicamente para AD, consistentes cos nosos descubrimentos anteriores.
A EA caracterízase por unha fase asintomática precoz (AsymAD), na que os individuos presentan acumulación de amiloide sen deterioro cognitivo clínico (5, 31). Esta etapa asintomática representa unha xanela crítica para a detección e intervención precoz. Anteriormente demostramos unha forte preservación modular do proteoma da rede cerebral AsymAD e AD en conxuntos de datos independentes (13, 17). Para garantir que a rede cerebral que descubrimos actualmente é consistente con estes descubrimentos anteriores, analizamos a preservación de 44 módulos no conxunto de datos replicados de 27 organizacións DLPFC. Estas organizacións inclúen casos de control (n = 10), AsymAD (n = 8) e AD (n = 9). As mostras de control e AD incluíronse na análise da nosa cohorte de cerebro de descubrimento (táboa S1B), mentres que os casos de AsymAD só eran únicos na cohorte de replicación. Estes casos de AsymAD tamén proviñan do banco de cerebros ADRC de Emory Goizueta. Aínda que a cognición era normal no momento da morte, os niveis de amiloide eran anormalmente altos (CERAD medio, 2,8 ± 0,5) (táboa S1B).
A análise TMT-MS destes 27 tecidos cerebrais deu lugar á cuantificación de 11.244 proteomas. Este reconto final inclúe só aquelas proteínas cuantificadas en polo menos o 50% das mostras. Este conxunto de datos replicados contén 8638 (98,0%) das 8817 proteínas detectadas na nosa análise cerebral de descubrimento, e ten case 3000 proteínas modificadas significativamente entre as cohortes de control e AD (P <0,05, despois da proba t pareada de Tukey para a análise da varianza) ( Táboa S2F). Entre estas proteínas expresadas de forma diferencial, o 910 tamén mostrou cambios significativos no nivel entre os casos de control do proteoma da EA e do cerebro (P <0,05, despois da proba t pareada de ANOVA Tukey). Paga a pena sinalar que estes marcadores 910 son moi consistentes na dirección do cambio entre proteomas (r = 0,94, P <1,0 × 10-200) (Figura S3A). Entre as proteínas aumentadas, as proteínas con cambios máis consistentes entre conxuntos de datos son principalmente membros dos módulos M5 e M18 ricos en glial (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 e GFAP). Entre as proteínas reducidas, as que experimentaron os cambios máis consistentes eran case exclusivamente membros do módulo M1 (NPTX2, VGF e RPH3A) asociado á sinapse. Verificamos ademais os cambios relacionados coa AD de midkine (MDK), CD44, proteína 1 relacionada con frizzled secretada (SFRP1) e VGF mediante transferencia western (Figura S3B). A análise de preservación de módulos mostrou que preto do 80% dos módulos de proteínas (34/44) do proteoma cerebral conserváronse significativamente no conxunto de datos de replicación (puntuación z> 1,96, P corrixido por FDR <0,05) (Figura S3C). Catorce destes módulos reserváronse especialmente entre os dous proteomas (puntuación z> 10, P corrixido por FDR <1,0 × 10−23). En xeral, o descubrimento e a replicación do alto grao de consistencia na expresión diferencial e na composición modular entre o proteoma cerebral destaca a reproducibilidade dos cambios nas proteínas da cortiza frontal da EA. Ademais, tamén confirmou que AsymAD e as enfermidades máis avanzadas teñen unha estrutura de rede cerebral moi similar.
Unha análise máis detallada da expresión diferencial no conxunto de datos de replicación cerebral destaca o grao significativo de cambios na proteína AsymAD, incluíndo un total de 151 proteínas significativamente cambiadas entre AsymAD e o control (P <0,05) (Figura S3D). En consonancia coa carga de amiloide, a APP no cerebro de AsymAD e AD aumentou significativamente. MAPT só cambia significativamente na AD, o que é consistente co aumento dos niveis de enredos e a súa coñecida correlación co declive cognitivo (5, 7). Os módulos ricos en glial (M5 e M18) reflíctese moito no aumento das proteínas en AsymAD, mentres que o módulo M1 relacionado coas neuronas é o máis representativo das proteínas diminuídas en AsymAD. Moitos destes marcadores de AsymAD mostran maiores cambios nas enfermidades sintomáticas. Entre estes marcadores atópase SMOC1, unha proteína glial pertencente a M18, que está asociada a tumores cerebrais e ao desenvolvemento dos ollos e dos membros (32). A MDK é un factor de crecemento de unión á heparina relacionado co crecemento celular e a anxioxénese (33), outro membro de M18. En comparación co grupo control, AsymAD aumentou significativamente, seguido dun maior aumento da DA. Pola contra, a proteína sináptica neuropentraxina 2 (NPTX2) reduciuse significativamente no cerebro AsymAD. NPTX2 estivo asociado previamente coa neurodexeneración e ten un papel recoñecido na mediación das sinapses excitatorias (34). En xeral, estes resultados revelan unha variedade de cambios preclínicos diferentes na proteína da EA que parecen progresar coa gravidade da enfermidade.
Dado que conseguimos unha gran profundidade de cobertura proteica no descubrimento do proteoma cerebral, estamos tentando comprender máis a fondo a súa superposición co transcriptoma AD a nivel de rede. Polo tanto, comparamos o proteoma cerebral que descubrimos co módulo que xeramos previamente a partir da medición de microarrays de 18.204 xenes en tecidos DLPFC de AD (n = 308) e control (n = 157) (13). superposición. En total, identificamos 20 módulos de ARN diferentes, moitos dos cales demostraron o enriquecemento de tipos celulares específicos, incluíndo neuronas, oligodendrocitos, astrocitos e microglia (figura 3A). Os múltiples cambios destes módulos en AD móstranse na Figura 3B. En consonancia coa nosa análise previa de superposición proteína-ARN usando o proteoma MS máis profundo sen marcar (uns 3000 proteínas) (13), a maioría dos 44 módulos da rede de proteomas do cerebro que atopamos están na rede de transcriptomas. Non hai ningunha superposición significativa. O noso descubrimento e replicación dos 34 módulos de proteínas que están moi retidos no proteoma cerebral, só 14 (~ 40 %) pasaron a proba exacta de Fisher (FET) demostraron ter unha superposición estatisticamente significativa co transcriptoma (Figura 3A). Compatible con reparación de danos no ADN (P-M25 e P-M19), tradución de proteínas (P-M7 e P-M20), unión/splicing de ARN (P-M16 e P-M21) e orientación de proteínas (P-M13 e P-). M23) non se solapa cos módulos do transcriptoma. Polo tanto, aínda que se usa un conxunto de datos de proteomas máis profundos na análise de solapamento actual (13), a maior parte do proteoma da rede AD non está asignado á rede de transcriptoma.
(A) FET hiperxeométrico demostra o enriquecemento de marcadores específicos de tipo celular no módulo de ARN do transcriptoma de AD (arriba) e o grao de superposición entre os módulos de ARN (eixe x) e proteína (eixe y) do cerebro de AD. (abaixo). A intensidade do sombreado vermello indica o grao de enriquecemento dos tipos de células no panel superior e a intensidade da superposición dos módulos no panel inferior. Os asteriscos indican significación estatística (P <0,05). (B) O grao de correlación entre os xenes característicos de cada módulo de transcriptoma e o estado de DA. Os módulos da esquerda son os máis negativamente correlacionados con AD (azul), e os da dereita son os máis positivamente correlacionados con AD (vermello). O valor de P corrixido por BH transformado en logaritmo indica o grao de significación estatística de cada correlación. (C) Módulos superpostos significativos con enriquecemento de tipo celular compartido. (D) Análise de correlación do cambio de dobra logarítmica 2 da proteína marcada (eixe x) e ARN (eixe y) no módulo de superposición. Móstrase o coeficiente de correlación de Pearson co valor P relevante. Micro, microglia; corpos celestes, astrocitos. CT, control.
A maioría dos módulos de proteína e ARN superpostos comparten perfís de enriquecemento de tipo celular similares e as direccións de cambio de AD consistentes (Figura 3, B e C). Noutras palabras, o módulo M1 relacionado coa sinapse do proteoma cerebral (PM1) está mapeado a tres módulos de ARN homólogo rico en neuronas (R-M1, R-M9 e R-M16), que están en AD. Ambos mostraron un nivel reducido. Do mesmo xeito, os módulos de proteínas M5 e M18 ricos en glial se solapan con módulos de ARN ricos en astrocitos e marcadores microgliais (R-M3, R-M7 e R-M10) e están moi implicados nas enfermidades Aumento. Estas características modulares compartidas entre os dous conxuntos de datos apoian aínda máis o enriquecemento do tipo celular e os cambios relacionados coa enfermidade que observamos no proteoma cerebral. Non obstante, observamos moitas diferenzas significativas entre os niveis de ARN e proteína dos marcadores individuais nestes módulos compartidos. A análise de correlación da expresión diferencial da proteómica e da transcriptómica das moléculas dentro destes módulos superpostos (Figura 3D) destaca esta inconsistencia. Por exemplo, APP e varias outras proteínas do módulo glial (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 e SFRP1) mostraron un aumento significativo no proteoma AD, pero case non houbo cambios no transcriptoma AD. Estes cambios específicos da proteína poden estar estreitamente relacionados coas placas amiloides (23, 35), destacando o proteoma como fonte de cambios patolóxicos, e estes cambios poden non reflectirse no transcriptoma.
Despois de analizar de forma independente os proteomas do cerebro e do LCR que descubrimos, realizamos unha análise exhaustiva dos dous conxuntos de datos para identificar biomarcadores de AD LCR relacionados coa fisiopatoloxía da rede cerebral. Primeiro debemos definir a superposición dos dous proteomas. Aínda que está amplamente aceptado que o LCR reflicte cambios neuroquímicos no cerebro da DA (4), o grao exacto de solapamento entre o cerebro da DA e o proteoma do LCR non está claro. Ao comparar o número de produtos xenéticos compartidos detectados nos nosos dous proteomas, descubrimos que case o 70% (n = 1936) das proteínas identificadas no líquido cefalorraquídeo tamén se cuantificaron no cerebro (Figura 4A). A maioría destas proteínas superpostas (n = 1721) están mapeadas nun dos 44 módulos de coexpresión do conxunto de datos do cerebro de descubrimento (Figura 4B). Como era de esperar, os seis módulos cerebrais máis grandes (M1 a M6) presentaron a maior cantidade de superposición de LCR. Non obstante, hai módulos cerebrais máis pequenos (por exemplo, M15 e M29) que alcanzan un grao de superposición inesperadamente alto, máis grande que un módulo cerebral o dobre do seu tamaño. Isto motívanos a adoptar un método máis detallado e dirixido estatísticamente para calcular a superposición entre o cerebro e o líquido cefalorraquídeo.
(A e B) As proteínas detectadas nos conxuntos de datos do cerebro de descubrimento e do LCR superpóñense. A maioría destas proteínas superpostas están asociadas a un dos 44 módulos de coexpresión da rede de coexpresión do cerebro. (C) Descubra a superposición entre o proteoma do líquido cefalorraquídeo e o proteoma da rede cerebral. Cada fila do mapa térmico representa unha análise de superposición separada do FET hiperxeométrico. A fila superior representa a superposición (sombreado gris/negro) entre o módulo cerebral e todo o proteoma do LCR. A segunda liña mostra que a superposición entre os módulos cerebrais e a proteína do LCR (sombreada en vermello) está significativamente regulada na EA (P <0,05). A terceira fila mostra que a superposición entre os módulos cerebrais e a proteína CSF (sombreado azul) está significativamente regulada á baixa en AD (P <0,05). Use o método BH para corrixir o valor P derivado do FET. (D) Panel do módulo plegable baseado na asociación de tipos de células e os termos GO relacionados. Estes paneis conteñen un total de 271 proteínas relacionadas co cerebro, que teñen unha expresión diferencial significativa no proteoma do LCR.
Usando FET de cola única, avaliamos a importancia da superposición de proteínas entre o proteoma do LCR e os módulos cerebrais individuais. A análise revelou que un total de 14 módulos cerebrais no conxunto de datos CSF teñen solapamentos estatisticamente significativos (FDR axustado P <0,05) e un módulo adicional (M18) cuxa superposición está próxima á significación (FDR axustada P = 0,06) (Figura 4C). , fila superior). Tamén estamos interesados en módulos que se solapan fortemente con proteínas de LCR expresadas de forma diferencial. Polo tanto, aplicamos dúas análises FET adicionais para determinar cal de (i) proteína CSF aumentou significativamente en AD e (ii) proteína CSF diminuíu significativamente en AD (P <0,05, proba t pareada AD/control) Módulos cerebrais con superposición significativa. entre eles. Como se mostra nas filas media e inferior da Figura 4C, estas análises adicionais mostran que 8 dos 44 módulos cerebrais se solapan significativamente coa proteína engadida no AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 e M38) . ), mentres que só dous módulos (M6 e M15) mostraron unha superposición significativa coa proteína reducida en AD LCR. Como era de esperar, os 10 módulos están nos 15 módulos con maior solapamento co proteoma do LCR. Polo tanto, asumimos que estes 15 módulos son fontes de alto rendemento de biomarcadores de LCR derivados do cerebro da EA.
Dobramos estes 15 módulos superpostos en cinco grandes paneis de proteínas en función da súa proximidade no diagrama de árbore WGCNA e da súa asociación con tipos celulares e ontoloxía xenética (Figura 4D). O primeiro panel contén módulos ricos en marcadores neuronais e proteínas relacionadas coa sinapse (M1 e M12). O panel sináptico contén un total de 94 proteínas, e os niveis no proteoma do LCR cambiaron significativamente, polo que é a maior fonte de marcadores de LCR relacionados co cerebro entre os cinco paneis. O segundo grupo (M6 e M15) demostrou a estreita conexión cos marcadores de células endoteliais e o corpo vascular, como a "cicatrización de feridas" (M6) e a "regulación da resposta inmune humoral" (M15). M15 tamén está moi relacionado co metabolismo das lipoproteínas, que está moi relacionado co endotelio (36). O panel vascular contén 34 marcadores de LCR relacionados co cerebro. O terceiro grupo inclúe módulos (M2 e M4) que están significativamente relacionados cos marcadores de oligodendrocitos e a proliferación celular. Por exemplo, os termos de ontoloxía de nivel superior de M2 inclúen "regulación positiva da replicación do ADN" e "proceso de biosíntese de purinas". Mentres tanto, os de M4 inclúen a "diferenciación de células gliais" e a "segregación cromosómica". O panel de mielinización contén 49 marcadores de LCR relacionados co cerebro.
O cuarto grupo contén a maioría de módulos (M30, M29, M18, M24 e M5) e case todos os módulos son significativamente ricos en marcadores de microglia e astrocitos. Similar ao panel de mielinización, o cuarto panel tamén contén módulos (M30, M29 e M18) que están estreitamente relacionados coa proliferación celular. Os outros módulos deste grupo están moi relacionados con termos inmunolóxicos, como "proceso de efecto inmune" (M5) e "regulación da resposta inmune" (M24). O grupo inmune glial contén 42 marcadores de LCR relacionados co cerebro. Finalmente, o último panel inclúe 52 marcadores relacionados co cerebro nos catro módulos (M44, M3, M33 e M38), todos eles no corpo relacionados co almacenamento de enerxía e o metabolismo. O máis grande destes módulos (M3) está moi relacionado coas mitocondrias e é rico en marcadores específicos de neuronas. M38 é un dos membros do módulo máis pequenos deste metaboloma e tamén presenta unha especificidade neuronal moderada.
En xeral, estes cinco paneis reflicten unha ampla gama de tipos de células e funcións no córtex da EA e conteñen colectivamente 271 marcadores de LCR relacionados co cerebro (táboa S2G). Para avaliar a validez destes resultados de MS, utilizamos o ensaio de extensión de proximidade (PEA), unha tecnoloxía baseada en anticorpos ortogonais con capacidades de multiplexación, alta sensibilidade e especificidade, e reanalizamos as mostras de líquido cefalorraquídeo que atopamos Un subconxunto destes 271 biomarcadores. (n = 36). Estes 36 obxectivos demostran o cambio no múltiplo AD de PEA, que está intimamente relacionado cos nosos achados baseados en MS (r = 0,87, P = 5,6 × 10-12), o que verificou con forza os resultados da nosa análise completa de MS (Figura S4). ).
Os temas biolóxicos enfatizados polos nosos cinco grupos, desde a sinalización sináptica ata o metabolismo enerxético, están todos relacionados coa patoxénese da EA (1-3). Polo tanto, os 15 módulos que conteñen estes paneis están relacionados coa patoloxía da DA no proteoma cerebral que descubrimos (Figura 2B). O máis destacable é a alta correlación patolóxica positiva entre os nosos módulos gliais e a forte correlación patolóxica negativa entre os nosos módulos neuronais máis grandes (M1 e M3). A análise da expresión diferencial do noso proteoma cerebral replicado (Figura S3D) tamén destaca as proteínas gliais derivadas de M5 e M18. En AsymAD e AD sintomática, as proteínas gliais máis aumentadas e as sinapses relacionadas con M1 A proteína é a que máis se reduce. Estas observacións indican que os 271 marcadores de líquido cefalorraquídeo que identificamos nos cinco grupos están relacionados cos procesos da enfermidade no córtex da EA, incluídos os que ocorren nas primeiras etapas asintomáticas.
Para analizar mellor a dirección do cambio das proteínas do panel no cerebro e no líquido cefalorraquídeo, debuxamos o seguinte para cada un dos 15 módulos superpostos: (i) atopou o nivel de abundancia do módulo no conxunto de datos do cerebro e (ii) o módulo. proteína A diferenza exprésase no líquido cefalorraquídeo (Figura S5). Como se mencionou anteriormente, WGCNA úsase para determinar a abundancia do módulo ou o valor característico da proteína no cerebro (13). O mapa de volcáns utilízase para describir a expresión diferencial de proteínas modulares no líquido cefalorraquídeo (AD/control). Estas cifras mostran que tres dos cinco paneis mostran diferentes tendencias de expresión no cerebro e no líquido cefalorraquídeo. Os dous módulos do panel de sinapse (M1 e M12) mostran unha diminución do nivel de abundancia no cerebro da EA, pero se solapan significativamente co aumento da proteína no LCR da EA (Figura S5A). Os módulos relacionados coas neuronas que conteñen o metaboloma (M3 e M38) mostraron patróns similares de expresión do cerebro e do líquido cefalorraquídeo inconsistentes (Figura S5E). O panel vascular tamén mostrou diferentes tendencias de expresión, aínda que os seus módulos (M6 e M15) aumentaron moderadamente no cerebro da EA e diminuíron no LCR enfermo (Figura S5B). Os dous paneis restantes conteñen grandes redes gliais cuxas proteínas están constantemente reguladas en ambos os compartimentos (Figura S5, C e D).
Teña en conta que estas tendencias non son comúns a todos os marcadores destes paneis. Por exemplo, o panel sináptico inclúe varias proteínas que se reducen significativamente no cerebro da EA e no LCR (Figura S5A). Entre estes marcadores de líquido cefalorraquídeo regulados á baixa están NPTX2 e VGF de M1, e a cromogranina B de M12. Non obstante, a pesar destas excepcións, a maioría dos nosos marcadores sinápticos están elevados no líquido cefalorraquídeo. En xeral, estas análises puideron distinguir tendencias estatisticamente significativas nos niveis do cerebro e do líquido cefalorraquídeo en cada un dos nosos cinco paneis. Estas tendencias destacan a relación complexa e a miúdo diferente entre a expresión da proteína do cerebro e do LCR na EA.
Despois, usamos a análise de replicación MS de alto rendemento (replicación CSF 1) para reducir o noso conxunto de 271 biomarcadores aos obxectivos máis prometedores e reproducibles (Figura 5A). A copia 1 de CSF contén un total de 96 mostras de Emory Goizueta ADRC, incluíndo control, AsymAD e cohorte AD (táboa S1A). Estes casos de EA caracterízanse por un deterioro cognitivo leve (MoCA medio, 20,0 ± 3,8) e cambios nos biomarcadores da EA confirmados no líquido cefalorraquídeo (táboa S1A). Ao contrario da análise de LCR que atopamos, esta replicación realízase mediante un método de MS "single shot" máis eficiente e de alto rendemento (sen fraccionamento fóra de liña), incluíndo un protocolo simplificado de preparación de mostras que elimina a necesidade de inmunodepleción de mostras individuais. . En vez diso, úsase unha única "canle de mellora" con esgotamento inmunitario para amplificar o sinal de proteínas menos abundantes (37). Aínda que reduce a cobertura total do proteoma, este método dun só tiro reduce significativamente o tempo da máquina e aumenta o número de mostras marcadas con TMT que poden ser analizadas viables (17, 38). En total, a análise identificou 6.487 péptidos, que mapearon a 1.183 proteomas en 96 casos. Do mesmo xeito que coa análise do LCR que atopamos, só se incluíron nos cálculos posteriores aquelas proteínas cuantificadas en polo menos o 50% das mostras, e os datos foron regresados para os efectos da idade e do sexo. Isto levou á cuantificación final de 792 proteomas, o 95% dos cales tamén foron identificados no conxunto de datos de LCR atopado.
(A) Obxectivos de proteínas de LCR relacionados co cerebro verificados na primeira cohorte de LCR replicado e incluídos no panel final (n = 60). (B a E) Niveis de biomarcadores do panel (puntuacións z compostas) medidos nas catro cohortes de replicación do LCR. Utilizáronse probas t pareadas ou ANOVA coa corrección posterior de Tukey para avaliar a significación estatística dos cambios na abundancia en cada análise replicada. CT, control.
Dado que estamos especialmente interesados en verificar os nosos 271 obxectivos de LCR relacionados co cerebro mediante unha análise exhaustiva, limitaremos o exame máis profundo deste proteoma replicado a estes marcadores. Entre estas 271 proteínas, detectáronse 100 na replicación 1 do LCR. A figura S6A mostra a expresión diferencial destes 100 marcadores superpostos entre as mostras de control e de replicación de AD. As histonas sinápticas e metabolitas aumentan máis na DA, mentres que as proteínas vasculares diminúen máis na enfermidade. A maioría dos 100 marcadores superpostos (n = 70) mantiveron a mesma dirección de cambio nos dous conxuntos de datos (Figura S6B). Estes 70 marcadores validados de LCR relacionados co cerebro (táboa S2H) reflicten en gran medida as tendencias de expresión dos paneis observadas anteriormente, é dicir, a regulación á baixa das proteínas vasculares e a regulación positiva de todos os outros paneis. Só 10 destas 70 proteínas validadas mostraron cambios na abundancia de AD que contradín estas tendencias do panel. Para xerar un panel que reflicta mellor a tendencia global do cerebro e do líquido cefalorraquídeo, excluímos estas 10 proteínas do panel de interese que finalmente verificamos (Figura 5A). Polo tanto, o noso panel inclúe finalmente un total de 60 proteínas verificadas en dúas cohortes independentes de LCR AD usando diferentes preparacións de mostras e análises da plataforma MS. Os gráficos de expresión da puntuación z destes paneis finais no control de copia 1 de CSF e os casos de AD confirmaron a tendencia do panel observada na cohorte de CSF que atopamos (Figura 5B).
Entre estas 60 proteínas, hai moléculas que se sabe que están asociadas coa DA, como a osteopontina (SPP1), que é unha citocina proinflamatoria que se asociou coa DA en moitos estudos (39-41), e GAP43, proteína sináptica A. que está claramente ligado á neurodexeneración (42). As proteínas máis totalmente verificadas son os marcadores relacionados con outras enfermidades neurodexenerativas, como a superóxido dismutase 1 (SOD1) relacionada coa esclerose lateral amiotrófica (ELA) e a desacarase relacionada coa enfermidade de Parkinson (PARK7). Tamén verificamos que moitos outros marcadores, como SMOC1 e a proteína 1 de sinalización de unión a membrana rica en cerebro (BASP1), teñen vínculos anteriores limitados á neurodexeneración. Paga a pena sinalar que, debido á súa baixa abundancia global no proteoma do LCR, é difícil para nós utilizar este método de detección dun disparo de alto rendemento para detectar de forma fiable MAPT e outras proteínas relacionadas coa EA (por exemplo, NEFL e NRGN). ) (43, 44).
Despois verificamos estes 60 marcadores de paneis prioritarios en tres análises repetidas adicionais. En CSF Copy 2, utilizamos un único TMT-MS para analizar unha cohorte independente de 297 mostras de control e AD de Emory Goizueta ADRC (17). A replicación 3 do LCR incluíu unha reanálise dos datos dispoñibles de TMT-MS de 120 pacientes control e AD de Lausanne, Suíza (45). Detectamos máis de dous terzos dos 60 marcadores prioritarios en cada conxunto de datos. Aínda que o estudo suízo utilizou diferentes plataformas de MS e métodos de cuantificación de TMT (45, 46), reproducimos fortemente as tendencias do noso panel en dúas análises repetidas (figura 5, C e D e táboas S2, I e J). Para avaliar a especificidade da enfermidade do noso grupo, utilizamos TMT-MS para analizar o cuarto conxunto de datos de replicación (replicación de LCR 4), que incluía non só casos de control (n = 18) e AD (n = 17), senón tamén de PD. n = 14)), ALS (n = 18) e mostras de demencia frontotemporal (FTD) (n = 11) (táboa S1A). Cuantificamos con éxito case dous terzos das proteínas do panel desta cohorte (38 de 60). Estes resultados destacan os cambios específicos de AD nos cinco paneis de biomarcadores (figura 5E e táboa S2K). O aumento no grupo de metabolitos mostrou a especificidade da DA máis forte, seguido do grupo de mielinización e glial. En menor medida, FTD tamén mostra un aumento entre estes paneis, o que pode reflectir cambios potenciais similares na rede (17). Pola contra, ALS e PD mostraron case os mesmos perfís de mielinización, glial e metaboloma que o grupo control. En xeral, a pesar das diferenzas na preparación de mostras, na plataforma MS e nos métodos de cuantificación de TMT, estas análises repetidas mostran que os nosos marcadores de paneis prioritarios teñen cambios específicos de AD altamente consistentes en máis de 500 mostras únicas de LCR.
A neurodexeneración da EA foi amplamente recoñecida varios anos antes da aparición dos síntomas cognitivos, polo que hai unha necesidade urxente de biomarcadores de AsymAD (5, 31). Non obstante, cada vez son máis as evidencias que mostran que a bioloxía de AsymAD está lonxe de ser homoxénea e a complexa interacción do risco e a resiliencia leva a grandes diferenzas individuais na progresión da enfermidade posterior (47). Aínda que se usan para identificar casos de AsymAD, os niveis de biomarcadores básicos de LCR (Aβ1-42, tau total e p-tau) non demostraron ser capaces de predecir de forma fiable quen progresará a demencia (4, 7), o que indica máis. necesario incluír ferramentas de biomarcadores holísticos baseadas en múltiples aspectos da fisioloxía cerebral para estratificar con precisión o risco desta poboación. Polo tanto, posteriormente analizamos o noso panel de biomarcadores validados por AD na poboación de AsymAD da copia 1 de LCR. Estes 31 casos de AsymAD mostraron niveis anormais de biomarcadores básicos (proporción ELISA Aβ1-42/tau total, <5,5) e cognición completa (MoCA media, 27,1). ± 2,2) (Táboa S1A). Ademais, todos os individuos con AsymAD teñen unha puntuación de demencia clínica de 0, o que indica que non hai evidencias dun descenso do rendemento cognitivo ou funcional diario.
Primeiro analizamos os niveis dos paneis validados en todas as 96 réplicas de LCR 1, incluída a cohorte AsymAD. Descubrimos que varios paneis do grupo AsymAD tiñan cambios significativos de abundancia semellantes a AD, o panel vascular mostrou unha tendencia á baixa en AsymAD, mentres que todos os outros paneis mostraron unha tendencia á alza (Figura 6A). Polo tanto, todos os paneis mostraron unha correlación moi significativa con ELISA Aβ1-42 e os niveis totais de tau (Figura 6B). Pola contra, a correlación entre o grupo e a puntuación MoCA é relativamente pobre. Un dos achados máis sorprendentes destas análises é a gran variedade de abundancias de paneis na cohorte AsymAD. Como se mostra na Figura 6A, o nivel do panel do grupo AsymAD adoita cruzar o nivel do panel do grupo de control e do grupo AD, mostrando unha variabilidade relativamente alta. Para explorar aínda máis esta heteroxeneidade de AsymAD, aplicamos a análise de escalado multidimensional (MDS) a 96 casos de replicación 1 de LCR. A análise MDS permite visualizar a semellanza entre casos en función de determinadas variables do conxunto de datos. Para esta análise de cluster, só usamos aqueles marcadores de panel validados que teñen un cambio estatisticamente significativo (P <0,05, AD/control) no nivel de descubrimento e replicación do LCR 1 (n = 29) (Táboa S2L). Esta análise produciu unha clara agrupación espacial entre os nosos casos de control e AD (Figura 6C). En cambio, algúns casos de AsymAD están claramente agrupados no grupo control, mentres que outros están localizados en casos de AD. Para explorar aínda máis esta heteroxeneidade de AsymAD, usamos o noso mapa MDS para definir dous grupos destes casos de AsymAD. O primeiro grupo incluíu casos de AsymAD agrupados máis preto do control (n = 19), mentres que o segundo grupo caracterizouse por casos de AsymAD cun perfil de marcador máis próximo ao DA (n = 12).
(A) O nivel de expresión (puntuación z) do grupo de biomarcadores de LCR nas 96 mostras da cohorte 1 de replicación de LCR, incluíndo AsymAD. Utilizouse a análise da varianza coa corrección posterior de Tukey para avaliar a significación estatística dos cambios de abundancia do panel. (B) Análise de correlación do nivel de abundancia de proteínas do panel (puntuación z) coa puntuación MoCA e o nivel total de tau en mostras ELISA Aβ1-42 e CSF copia 1. Móstrase o coeficiente de correlación de Pearson co valor P relevante. (C) O MDS de 96 casos de copia 1 de CSF baseouse nos niveis de abundancia de 29 marcadores de paneis validados, que se modificaron significativamente tanto nos conxuntos de datos de descubrimento como de CSF copia 1 [P <0,05 AD/control (CT)]. Esta análise utilizouse para dividir o grupo AsymAD en subgrupos control (n = 19) e AD (n = 12). (D) O gráfico do volcán mostra a expresión diferencial de todas as proteínas de replicación 1 do LCR con cambio de dobra log2 (eixe x) en relación ao valor P estatístico -log10 entre os dous subgrupos de AsymAD. Os biomarcadores do panel son de cores. (E) O nivel de abundancia de replicación do LCR 1 dos biomarcadores do grupo de selección exprésase de forma diferencial entre os subgrupos de AsymAD. Utilizouse a análise de varianza post-axustada de Tukey para avaliar a significación estatística.
Examinamos a expresión diferencial de proteínas entre estes casos de AsymAD de control e de tipo AD (Figura 6D e táboa S2L). O mapa de volcáns resultante mostra que 14 marcadores de paneis cambiaron significativamente entre os dous grupos. A maioría destes marcadores son membros da sinapse e do metaboloma. Non obstante, a SOD1 e o substrato da proteína quinase C rico en alanina miristoilada (MARCKS), que son membros dos grupos inmunes da mielina e da glial, respectivamente, tamén pertencen a este grupo (Figura 6, D e E). O panel vascular tamén contribuíu con dous marcadores que se reduciron significativamente no grupo AsymAD tipo AD, incluíndo a proteína de unión a AE 1 (AEBP1) e o membro da familia do complemento C9. Non houbo diferenzas significativas entre o control e os subgrupos AsymAD tipo AD en ELISA AB1-42 (P = 0,38) e p-tau (P = 0,28), pero efectivamente houbo unha diferenza significativa no nivel total de tau (P = 0,0031). ) (Fig. S7). Hai varios marcadores de paneis que indican que os cambios entre os dous subgrupos de AsymAD son máis significativos que os niveis totais de tau (por exemplo, YWHAZ, SOD1 e MDH1) (Figura 6E). En xeral, estes resultados indican que o noso panel validado pode conter biomarcadores que poden subtipo e estratificación do risco potencial de pacientes con enfermidade asintomática.
Hai unha necesidade urxente de ferramentas de biomarcadores baseadas no sistema para medir e orientar mellor as diversas fisiopatoloxías detrás da EA. Espérase que estas ferramentas non só cambien o noso marco de diagnóstico da EA, senón que tamén promovan a adopción de estratexias de tratamento eficaces e específicas para o paciente (1, 2). Para iso, aplicamos un enfoque de proteómica integral imparcial ao cerebro da EA e ao LCR para identificar biomarcadores de LCR baseados na web que reflicten unha ampla gama de fisiopatoloxía baseada no cerebro. A nosa análise produciu cinco paneis de biomarcadores de LCR, que (i) reflicten sinapses, vasos sanguíneos, mielina, disfunción inmune e metabólica; (ii) demostrar unha forte reproducibilidade en diferentes plataformas MS; (iii) Mostrar cambios progresivos específicos da enfermidade ao longo dos estadios iniciais e finais da EA. En xeral, estes achados representan un paso prometedor para o desenvolvemento de ferramentas de biomarcadores diversas, fiables e orientadas á web para a investigación da EA e as aplicacións clínicas.
Os nosos resultados demostran a organización altamente conservada do proteoma da rede cerebral da AD e apoian o seu uso como áncora para o desenvolvemento de biomarcadores baseados no sistema. A nosa análise mostra que dous conxuntos de datos TMT-MS independentes que conteñen cerebros AD e AsymAD teñen unha forte modularidade. Estes achados amplían o noso traballo anterior, demostrando a preservación dos poderosos módulos de máis de 2.000 tecidos cerebrais de múltiples cohortes independentes no córtex frontal, parietal e temporal (17). Esta rede de consenso reflicte varios cambios relacionados coa enfermidade observados na investigación actual, incluíndo o aumento de módulos inflamatorios ricos en glial e a diminución de módulos ricos en neuronas. Como a investigación actual, esta rede a gran escala tamén presenta cambios modulares significativos en AsymAD, mostrando unha variedade de fisiopatoloxía preclínica diferentes (17).
Non obstante, dentro deste marco baseado en sistemas altamente conservador, hai unha heteroxeneidade biolóxica máis fina, especialmente entre os individuos nos estadios iniciais da EA. O noso panel de biomarcadores é capaz de representar dous subgrupos en AsymAD, que demostran a expresión diferencial significativa de múltiples marcadores de LCR. O noso grupo puido destacar as diferenzas biolóxicas entre estes dous subgrupos, que non eran obvias a nivel dos biomarcadores básicos da EA. En comparación co grupo control, as relacións Aβ1-42/tau total destes individuos AsymAD foron anormalmente baixas. Non obstante, só os niveis totais de tau foron significativamente diferentes entre os dous subgrupos de AsymAD, mentres que os niveis de Aβ1-42 e p-tau seguían sendo relativamente comparables. Dado que a tau alta de LCR parece ser un mellor predictor de síntomas cognitivos que os niveis de Aβ1-42 (7), sospeitamos que as dúas cohortes de AsymAD poden ter riscos diferentes de progresión da enfermidade. Dado o tamaño limitado da mostra do noso AsymAD e a falta de datos lonxitudinais, é necesario investigar máis para sacar estas conclusións con confianza. Non obstante, estes resultados indican que un panel de LCR baseado no sistema pode mellorar a nosa capacidade para estratificar eficazmente os individuos durante a fase asintomática da enfermidade.
En xeral, os nosos descubrimentos apoian o papel de múltiples funcións biolóxicas na patoxénese da EA. Non obstante, o metabolismo enerxético desregulado converteuse no tema destacado dos nosos cinco paneis de etiquetado validados. As proteínas metabólicas, como a hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase 1 (HPRT1) e a lactato deshidroxenase A (LDHA), son os biomarcadores sinápticos máis sólidamente validados, o que indica que o aumento de AD LCR é un sexo altamente reproducible. Os nosos vasos sanguíneos e paneis gliais tamén conteñen varios marcadores implicados no metabolismo das substancias oxidativas. Estes achados son consistentes co papel clave que xogan os procesos metabólicos en todo o cerebro, non só para satisfacer a alta demanda de enerxía das neuronas, senón tamén para satisfacer a alta demanda de enerxía dos astrocitos e outras células gliais (17, 48). Os nosos resultados apoian a crecente evidencia de que os cambios no potencial redox e a interrupción das vías enerxéticas poden ser o vínculo central entre varios procesos clave implicados na patoxénese da EA, incluíndo trastornos mitocondriais, inflamación mediada pola glial e dano vascular (49). Ademais, os biomarcadores metabólicos do líquido cefalorraquídeo conteñen un gran número de proteínas ricas diferencialmente entre o noso control e os subgrupos AsymAD semellantes a AD, o que suxire que a interrupción destas vías de enerxía e redox pode ser crítica na fase preclínica da enfermidade.
As diferentes tendencias do paneis do cerebro e do líquido cefalorraquídeo que observamos tamén teñen implicacións biolóxicas interesantes. As sinapses e metabolomas ricos en neuronas mostran niveis diminuídos no cerebro da EA e aumento da abundancia no líquido cefalorraquídeo. Dado que as neuronas son ricas en mitocondrias produtoras de enerxía nas sinapses para proporcionar enerxía aos seus numerosos sinais especializados (50), espérase a semellanza dos perfís de expresión destes dous grupos de neuronas. A perda de neuronas e a extrusión de células danadas poden explicar estas tendencias do paneis do cerebro e do LCR nas enfermidades posteriores, pero non poden explicar os cambios iniciais do panel que observamos (13). Unha posible explicación para estes achados na enfermidade asintomática precoz é a poda sináptica anormal. Novas evidencias en modelos de rato suxiren que a fagocitose sináptica mediada pola microglia pode activarse de forma anormal na EA e levar á perda precoz da sinapse no cerebro (51). Este material sináptico descartado pode acumularse no LCR, polo que observamos o aumento do LCR no panel neuronal. A poda sináptica mediada polo sistema inmune tamén pode explicar parcialmente o aumento das proteínas gliais que observamos no cerebro e no líquido cefalorraquídeo ao longo do proceso da enfermidade. Ademais da poda sináptica, as anomalías xerais na vía exocítica tamén poden levar a diferentes expresións do cerebro e do LCR dos marcadores neuronais. Varios estudos demostraron que o contido dos exosomas na patoxénese do cerebro da EA cambiou (52). A vía extracelular tamén está implicada na proliferación de Aβ (53, 54). Paga a pena notar que a supresión da secreción exosomal pode reducir a patoloxía similar á DA en modelos de ratos transxénicos AD (55).
Ao mesmo tempo, a proteína do panel vascular mostrou un aumento moderado no cerebro da DA, pero diminuíu significativamente no LCR. A disfunción da barreira hematoencefálica (BBB) pode explicar en parte estes achados. Moitos estudos independentes post mortem en humanos demostraron a ruptura do BBB na AD (56, 57). Estes estudos confirmaron varias actividades anormais que rodean esta capa de células endoteliais estreitamente selada, incluíndo a fuga capilar cerebral e a acumulación perivascular de proteínas transmitidas polo sangue (57). Isto pode proporcionar unha explicación sinxela para as proteínas vasculares elevadas no cerebro, pero non pode explicar completamente o esgotamento destas mesmas proteínas no líquido cefalorraquídeo. Unha posibilidade é que o sistema nervioso central estea illando activamente estas moléculas para resolver o problema do aumento da inflamación e do estrés oxidativo. A redución nalgunhas das proteínas máis graves do LCR neste panel, especialmente as implicadas na regulación das lipoproteínas, está relacionada coa inhibición de niveis nocivos de inflamación e o proceso neuroprotector das especies reactivas do osíxeno. Isto é certo para a paroxonase 1 (PON1), un encima de unión a lipoproteínas responsable de reducir os niveis de estrés oxidativo na circulación (58, 59). O precursor de alfa-1-microglobulina/bikunina (AMBP) é outro marcador significativamente regulado á baixa do grupo vascular. É o precursor do transportador de lípidos bikunina, que tamén está implicado na supresión da inflamación e na protección neurolóxica (60, 61).
A pesar de varias hipóteses interesantes, a incapacidade de detectar directamente os mecanismos de enfermidades bioquímicas é unha limitación ben coñecida da análise proteómica impulsada polo descubrimento. Polo tanto, é necesaria máis investigación para definir con confianza os mecanismos detrás destes paneis de biomarcadores. Para avanzar cara ao desenvolvemento da análise clínica baseada na EM, a dirección futura tamén require o uso de métodos cuantitativos dirixidos para a verificación de biomarcadores a gran escala, como o seguimento selectivo ou paralelo de reaccións (62). Recentemente utilizamos o seguimento de reaccións paralelas (63) para validar moitos dos cambios de proteínas do LCR descritos aquí. Varios obxectivos de paneis prioritarios cuantificáronse cunha precisión significativa, incluíndo YWHAZ, ALDOA e SMOC1, que se asignan aos nosos paneis de sinapse, metabolismo e inflamación, respectivamente (63). A adquisición de datos independente (DIA) e outras estratexias baseadas en MS tamén poden ser útiles para a verificación do obxectivo. Bud et al. (64) Demostrouse recentemente que hai unha superposición significativa entre os biomarcadores de AD identificados no noso conxunto de datos de descubrimento de LCR e o conxunto de datos independente DIA-MS, que consta de case 200 mostras de LCR de tres cohortes europeas diferentes. Estes estudos recentes apoian o potencial dos nosos paneis para transformarse nunha detección fiable baseada en MS. A detección tradicional de anticorpos e aptámeros tamén é importante para o desenvolvemento de biomarcadores clave da EA. Debido á baixa abundancia de LCR, é máis difícil detectar estes biomarcadores mediante métodos de MS de alto rendemento. NEFL e NRGN son dous destes exemplos de biomarcadores de LCR de baixa abundancia, que se asignan ao panel na nosa análise completa, pero que non se poden detectar de forma fiable usando a nosa única estratexia de MS. As estratexias de orientación baseadas en múltiples anticorpos, como a PEA, poden promover a transformación clínica destes marcadores.
En xeral, este estudo proporciona un enfoque proteómico único para a identificación e verificación de biomarcadores da EA de LCR baseado en diferentes sistemas. A optimización destes paneis de marcadores en cohortes adicionais de AD e plataformas de MS pode resultar prometedora para avanzar na estratificación e tratamento do risco de AD. Os estudos que avalían o nivel lonxitudinal destes paneis ao longo do tempo tamén son fundamentais para determinar que combinación de marcadores estratifica mellor o risco de enfermidade precoz e cambios na gravidade da enfermidade.
Agás as 3 mostras copiadas por CSF, todas as mostras de CSF utilizadas neste estudo foron recollidas baixo os auspicios de Emory ADRC ou institucións de investigación estreitamente relacionadas. Nestes estudos de proteómica utilizáronse un total de catro conxuntos de mostras de LCR de Emory. A cohorte de LCR contén mostras de 20 controis sans e 20 pacientes con AD. A copia 1 de CSF inclúe mostras de 32 controis sans, 31 individuos AsymAD e 33 individuos AD. A copia 2 de CSF contén 147 controis e 150 mostras AD. A cohorte 4 de replicación de LCR multi-enfermidade incluíu 18 controis, 17 AD, 19 ALS, 13 PD e 11 mostras FTD. Segundo o acordo aprobado pola Xunta de Revisión Institucional da Universidade de Emory, todos os participantes no estudo Emory obtiveron o seu consentimento informado. Segundo as Directrices de Mellores Prácticas do Instituto Nacional de Envellecemento de 2014 para os centros de Alzheimer (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html), o líquido cefalorraquídeo foi recollido e almacenado mediante punción lumbar. Os pacientes control e AsymAD e AD recibiron avaliación cognitiva estandarizada na Clínica de Neuroloxía Cognitiva Emory ou en Goizueta ADRC. As súas mostras de líquido cefalorraquídeo foron probadas por INNO-BIA AlzBio3 Luminex para a análise de ELISA Aβ1-42, tau total e p-tau (65). Os valores ELISA utilízanse para apoiar a clasificación diagnóstica dos suxeitos en función dos criterios de corte de biomarcadores da EA establecidos (66, 67). Tamén se obteñen datos demográficos e diagnósticos básicos para outros diagnósticos de LCR (FTD, ALS e PD) de Emory ADRC ou institucións de investigación afiliadas. Os metadatos de casos resumidos para estes casos de LCR de Emory pódense atopar na táboa S1A. As características da cohorte suíza de replicación 3 do LCR publicáronse previamente (45).
CSF atopou a mostra. Para aumentar a profundidade do noso descubrimento do conxunto de datos de LCR, realizouse o consumo inmune de proteínas de alta abundancia antes da tripsinización. En resumo, colocáronse 130 μl de LCR de 40 mostras individuais de LCR e un volume igual (130 μl) de resina de esgotamento de proteínas en abundancia Top14 High Select (Thermo Fisher Scientific, A36372) nunha columna de rotación (Thermo Fisher Scientific, A89868) na sala. temperatura de incubación). Despois de xirar durante 15 minutos, centrifugue a mostra a 1000 g durante 2 minutos. Utilizouse un dispositivo de filtro ultracentrífugo 3K (Millipore, UFC500396) para concentrar a mostra do efluente centrifugando a 14.000 g durante 30 minutos. Diluír todos os volumes de mostra a 75 μl con solución salina tamponada con fosfato. A concentración de proteína avaliouse polo método do ácido bicinconínico (BCA) segundo o protocolo do fabricante (Thermo Fisher Scientific). O LCR inmunodepleto (60 μl) das 40 mostras foi dixerido con lisil endopeptidase (LysC) e tripsina. En resumo, a mostra reduciuse e alquilouse con 1,2 μl de tris-2(-carboxietil)-fosfina 0,5 M e 3 μl de cloroacetamida 0,8 M a 90 °C durante 10 minutos, e despois sonicóuse nun baño de auga durante 15 minutos. A mostra diluíuse con 193 μl de tampón de urea 8 M [urea 8 M e NaHPO4 100 mM (pH 8,5)] ata unha concentración final de urea 6 M. LysC (4,5 μg; Wako) úsase para a dixestión nocturna a temperatura ambiente. A mostra foi entón diluída a urea 1 M con bicarbonato de amonio (ABC) 50 mM (68). Engade unha cantidade igual (4,5 μg) de tripsina (Promega) e incuba a mostra durante 12 horas. Acidifique a solución peptídica dixerida ata unha concentración final de ácido fórmico (FA) 1 % e ácido trifluoroacético (TFA) 0,1 % (66), e despois desalar cunha columna Sep-Pak C18 de 50 mg (Augas) como se describe anteriormente (25). . Despois eluíuse o péptido en 1 ml de acetonitrilo ao 50% (ACN). Para estandarizar a cuantificación de proteínas en lotes (25), combináronse alícuotas de 100 μl das 40 mostras de LCR para xerar unha mostra mixta, que despois se dividiu en cinco mostras de estándar interno global (GIS) (48). Todas as mostras individuais e os patróns combinados secan mediante un baleiro de alta velocidade (Labconco).
CSF copia a mostra. Dayon e os seus colegas describiron previamente o esgotamento inmune e a dixestión das mostras da copia 3 de LCR (45, 46). As mostras replicadas restantes non foron inmunodepletas individualmente. Dixerir estas mostras non eliminadas en tripsina como se describiu anteriormente (17). Para cada análise repetida, xuntáronse alícuotas de 120 μl do péptido eluído de cada mostra e dividíronse en alícuotas de iguais volumes para ser usadas como estándar interno global marcado con TMT (48). Todas as mostras individuais e os patróns combinados secan mediante un baleiro de alta velocidade (Labconco). Co fin de mellorar o sinal da proteína CSF de baixa abundancia, ao combinar 125 μl de cada mostra, preparouse unha mostra "mellorada" para cada análise replicada [é dicir, unha mostra biolóxica que imita a mostra de investigación, pero a cantidade dispoñible é moito máis grande (37, 69)] fusionado nunha mostra mixta de LCR (17). A mostra mixta foi despois inmunoeliminada usando 12 ml de resina de eliminación de proteínas de abundancia Top14 High Select (Thermo Fisher Scientific, A36372), dixerida como se describe anteriormente e incluída na etiquetaxe TMT múltiple posterior.
Hora de publicación: 27-Ago-2021